一种柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定方法与流程

1.本发明涉及一种柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定方法，属于柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留测定的技术领域。


背景技术：

2.我国是柞蚕的发源地，也是世界柞蚕主要养殖国，柞蚕茧年产量约8.5万t，占世界总产量90％以上。柞蚕在野外柞园中放养，柞园与农田及防护林、果园等交错分布，农林害虫防控过程中使用的农药可通过雾滴飘移污染柞树叶而引起柞蚕中毒，从而导致柞蚕严重减产，给蚕茧生产造成巨大经济损失。苦参碱是一种高效广谱植物源杀虫剂，对蛾类和蝶类昆虫的幼虫具有速效性和持久性毒杀作用。近些年来因其具有低毒、低残留等优点，在防治各种松毛虫、茶毛虫、菜青虫等农林害虫领域里被广泛使用。柞蚕与毛虫同为鳞翅目昆虫，苦参碱类农药的施用势必会给柞蚕生产带来安全风险，柞蚕中毒事件时有发生。
3.柞蚕属于动物源样品，基质复杂，且少量苦参碱和氧化苦参碱即可引起柞蚕中毒，因此，现有技术中虽然也有关于苦参碱残留测定的少许报道，但并不适于柞蚕的检测，如申请号为202011608584.2的专利公开了一种果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，用于果蔬类的检测，采用其方法并不能实现对柞蚕的提取和净化，也无法完成对苦参碱和氧化苦参碱的同时检测，且其对苦参碱检出限为0.1mg/kg，对于少量苦参碱即可引起中毒的柞蚕并不适用。目前还未见柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留检测的相关报道，使柞蚕苦参碱类农药残留的风险评估难以进行。


技术实现要素：

4.本发明提供一种柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定方法，可实现柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的同时检测，苦参碱检出限为0.05μg/kg，氧化苦参碱检出限0.1μg/kg。
5.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定方法，用含0.2
±
0.02％氨水的80
±
2％乙腈水溶液超声提取样品，经分散固相萃取净化、浓缩复溶，以kinetex 2.6μm biphenylbiphenyl色谱柱(100mm
×
3.0mm)分离，0.1
±
0.01％甲酸水和0.1
±
0.01％甲酸甲醇为流动相梯度洗脱，电喷雾电离(esi)，正离子模式多反应监测(+mrm)下检测，苦参碱以离子对q1/q3：249.2/148.3为定量离子对、以离子对q1/q3：249.2/150.3为定性离子对，氧化苦参碱以离子对q1/q3：265.2/247.3为定量离子对，以离子对q1/q3：265.2/148.2为定性离子对，外标法定量。
7.本技术％未特别说明的，均为体积百分比。
8.上述含0.2
±
0.02％氨水的80
±
2％乙腈水溶液，指乙腈水溶液中乙腈的体积含量为80
±
2％，乙腈水溶液中含有0.2
±
0.02％体积的氨水，以下用80
±
2％乙腈水溶液(含0.2
±
0.02％氨水)表示，其它类似表达，含义也类似。0.1
±
0.01％甲酸水为甲酸体积含量为
0.1
±
0.01％的甲酸水溶液；0.1
±
0.01％甲酸甲醇为甲酸体积含量为0.1
±
0.01％的甲酸甲醇溶液，其它类似表达，含义也类似。
9.上述方法具有较高的灵敏度、准确度和重现性，可用于柞蚕中苦参碱、氧化苦参碱残留量的测定，并为相关产品中苦参碱、氧化苦参碱残留量检测提供了方法依据。
10.发明人发现，柞蚕，属于动物源样品，基质复杂，使用现有用于果蔬、茶叶、蜂蜜等的提取剂，提取率极低，无法完成检测，而采用提取剂80
±
2％乙腈水溶液(含0.2
±
0.02％氨水)提取效率显著高于其它试剂；超声提取结合无水硫酸钠作提取盐，相比于不采取超声以及采用其它提取盐，回收率显著提升，结合本技术净化处理及其它条件的选择，可精准快速完成对柞蚕的检测。
11.以0.1
±
0.01％甲酸水和0.1
±
0.01％甲酸甲醇为流动相洗脱，苦参碱、氧化苦参碱的分离度、峰型及响应值均为最好，满足检测要求，且绿色环保、配制简单。
12.现有技术中多采用inspirehilic色谱柱(150mm
×
2.1mm
×
3μm)，hilic柱为正向色谱柱，使用溶剂受限，只能使用70％以上乙腈，难以预平衡，且价格昂贵，使用寿命短；而本技术采用kinetex
○
r2.6μm biphenyl柱，是款核-壳联苯基色谱柱，这种由核-壳颗粒带来的高性能配合独特的固定相，可以实现反相保留以及增强极性与芳香类化合物的选择性，且能显著改善色谱峰形，提高灵敏度，其色谱分离相互作用机理：由联苯基双环结构所产生的高密度电子云可起到类似弱阳离子交换的作用，使得碱性分析物的保留增强。
13.上述苦参碱和氧化苦参碱离子对的选择，可以确保检测的响应值和稳定性。
14.本技术苦参碱最低检出限为0.05μg/kg；氧化苦参碱最低检出限为0.1μg/kg。本技术在空白柞蚕样品中加入低浓度苦参碱、氧化苦参碱标液，制备加标样品，按本文方法进行提取测定并计算其信噪比，以3倍信噪比(s/n＝3)时对应的加标量为最低检出限，充分考虑到样品基质的干扰及回收率的影响，是真正意义上的方法检出限。
15.为了进一步提高提取效率，提取样品的方法为：将样品与含0.2
±
0.02％氨水的80
±
2％乙腈水溶液混合后，涡旋1
±
0.2min，超声提取20
±
2min，向离心管中加5.0g无水硫酸钠，再涡旋提取2
±
0.2min后，4℃下、9500
±
500r/min离心5
±
0.5min，上清液待净化。
16.上述以无水硫酸钠为提取盐，可使得回收率得到显著的提升。
17.测试时，先将待测柞蚕绞碎至匀浆状态，得到样品，然后再称取样品进行提取等后续操作；优选，含0.2
±
0.02％氨水的80
±
2％乙腈水溶液的用量为4
±
0.5ml/g样品；无水硫酸钠的质量用量为样品质量的2
±
0.2倍。
18.为了提高测试的准确性和有效性，萃取净化的方法为：将提取样品所得的上清液加入到安捷伦quechers试剂净化管中，涡旋2
±
0.2min，4℃下、5000
±
500r/min离心5
±
0.5min，上清液为净化液，安捷伦quechers试剂净化管中装有147.7mg psa，15.1mg gcb和887.2mg硫酸镁。
19.净化可以通过固相萃取柱或分散固相萃取剂来净化样品，以去除样品基质中的有机酸、色素、糖类、脂肪和磷脂等杂质，降低基质效应对检测结果的影响，同时尽可能地减少对目标化合物的吸附，达到检测要求。然而，发明人研究发现，由于柞蚕基质复杂，其萃取净化是非常重要的，不同的萃取净化方法和配方的效果差异较大，采用quechers净化试剂(内含147.7mg psa，15.1mg gcb，887.2mg硫酸镁)相比于其它方式，可显著提高苦参碱和氧化苦参碱的回收率，简单、快速，本底干扰小。
20.为了减少损失率，浓缩复溶的方法为：将萃取净化后的上清液于浓缩管中，于40
±
2℃水浴中氮吹至近干，加入复溶溶剂溶解，涡旋30
±
2s，超声2
±
0.2min，涡旋1
±
0.1min后，将溶液转移至离心管中，13000
±
500r/min离心5
±
0.2min，上清液过0.22μm滤膜后，进行液相色谱-串联质谱测定。上述浓缩时的温度选择非常重要，温度过高或过低都会导致苦参碱和氧化苦参碱的损失率增加。
21.为了进一步提高回收效率，复溶溶剂为含0.1
±
0.01％甲酸的50
±
1％甲醇水溶液。
22.50
±
1％甲醇溶液(含0.1
±
0.01％甲酸)复溶液的选择，相比于其它试剂，有着明显更优的回收率。
23.苦参碱和氧化苦参碱在0.1～50.0ng/ml范围内均呈良好的线性关系，苦参碱的回归方程为y＝10399.42713x+191.40500，相关系数r大于0.999；氧化苦参碱的回归方程为y＝11045.75073x+174.69791，相关系数r均大于0.999。y为被测组分定量用子离子色谱峰面积，x为浓度。
24.本技术苦参碱检出限为0.05μg/kg，氧化苦参碱检出限0.1μg/kg。
25.本发明未提及的技术均参照现有技术。
26.本技术柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留量的测定方法，通过色谱质谱条件及样品前处理方法的改进，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定柞蚕中苦参碱、氧化苦参碱残留量分析方法，该方法的灵敏度、准确度、精密度均满足gb/t 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求，填补了国家相关检测方法的空白，为开展柞蚕中苦参碱类农药残留检测工作以及风险评估提供方法依据，为研究苦参碱类农药对柞蚕的毒性和安全性试验提供技术支撑。
附图说明
27.图1为苦参碱、氧化苦参碱标准溶液的多反应监测(mrm)色谱图(10ng/ml)；
28.图2为苦参碱、氧化苦参碱标准溶液的总离子流色谱图(10ng/ml)；
29.图3为苦参碱定量离子对249.2/148.3的信噪比图(加标量0.05μg/kg)；
30.图4为氧化苦参碱定量离子对265.2/247.3的信噪比图(加标量0.1μg/kg)；
具体实施方式
31.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
32.6种柞蚕幼虫：空白对照组健康柞蚕幼虫(编号为kb)，不同浓度苦参碱类农药中毒的4龄柞蚕幼虫(编号为k48-1、k48-2、k96-1)、5龄柞蚕幼虫(编号为k24-1、k24-2)，均由吉林省蚕业科学研究院提供，于-18℃冷冻保存。
33.设备：api4000+超高效液相色谱-串联质谱联用仪(esi离子源，美国ab sciex公司)；2.6μm biphenyl色谱柱(100mm
×
3.0mm)；涡旋混合器(美国talboys)；kq-500de超声波清洗器(昆山超声仪器)；kh20r
‑ⅱ
高速冷冻离心机(湖南凯达)；ttl-dc吹氮仪(北京同泰联科技)；
34.试剂：标准物质：苦参碱(纯度98.9％，上海安普实验科技)，氧化苦参碱(纯度
99.9％，天津阿尔塔科技)；色谱纯甲醇、乙腈(fisher scientific)；色谱纯甲酸(cnw)；分析纯浓氨水(28％，天津致远化学试剂)；分析纯无水硫酸钠(北京化工)；quechers试剂净化管(5982-5256安捷伦公司)：15ml离心管内装147.7mg psa，15.1mg gcb，887.2mg硫酸镁；quechers试剂提取包(5982-5650安捷伦公司)：内含4g硫酸镁，1g氯化钠，1g柠檬酸钠，0.5g柠檬酸氢二钠；0.1％甲酸-水溶液；0.1％甲酸-甲醇液；50％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)；80％乙腈水溶液(含0.2％氨水)；0.2μm滤膜(pall corporation)。
35.各例中，未特别说明温度的，均室温下完成(15～25℃)。
36.实施例1
37.标准溶液配制：
38.苦参碱标准储备溶液：准确称取10mg(精确至0.1mg)苦参碱于10ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml苦参碱标准储备液，避光-18℃保存。
39.氧化苦参碱标准储备溶液：准确称取10mg(精确至0.1mg)氧化苦参碱于10ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml氧化苦参碱标准储备液，避光-18℃保存。
40.混合标准溶液(10μg/ml)配制：分别准确吸取苦参碱和氧化苦参碱标准储备液(1mg/ml)0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈稀释并定容至10ml。
41.混合标准使用液(100ng/ml)配制：准确吸取混合标准溶液(10μg/ml)0.1ml于10ml容量瓶中，用50％甲醇溶液(含0.1％甲酸)定容。
42.混合标准使用液(10ng/ml)配制：准确吸取混合标准使用液(100ng/ml)1.0ml于10ml容量瓶中，用50％甲醇溶液(含0.1％甲酸)定容。
43.混合标准工作溶液系列配制：分别吸取10ng/ml混合标准使用液10μl、50μl、100μl，及100ng/ml混合标准使用液50μl、100μl、200μl、500μl于7个样品瓶中，分别用50％甲醇溶液(含0.1％甲酸)定容至1.0ml，混匀。配制的混合标准工作溶液浓度分别为0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml。
44.样品处理：
45.提取：利用绞肉机将柞蚕绞碎至匀浆状态、得试样，称取试样2.50g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入80％乙腈水溶液(含0.2％氨水)10ml，涡旋(2500r/min)1min，超声(超声频率：40khz)提取20min，向离心管中加5.0g无水硫酸钠，再涡旋(2500r/min)提取2min后，9500r/min离心5min(4℃)，上清液待净化。
46.净化：吸取5.0ml上清提取液加入到安捷伦quechers试剂净化管中(15ml离心管内装147.7mg psa，15.1mg gcb，887.2mg硫酸镁)，涡旋2min，5000r/min离心5min(4℃)，上清液为净化液。
47.准确吸取2.00ml净化液于10ml浓缩管中，于40℃水浴中氮吹至近干，准确加入1.0ml50％甲醇溶液(含0.1％甲酸)溶解残渣，涡旋30s，超声2min，涡旋1min后，将溶液转移至1.5ml离心管中，13000r/min离心5min，上清液过0.22μm滤膜后，进行液相色谱-串联质谱测定。
48.液相色谱-质谱/质谱条件：
49.色谱条件2.6μm biphenyl色谱柱(100mm
×
3.0mm)；柱温40℃；流速：0.4ml/min；进样量：5μl；流动相：a泵为0.1％甲酸-水，b泵为0.1％甲酸-甲醇。流动相及
梯度洗脱条件见表1。
50.表1流动相及梯度洗脱条件
[0051][0052]
质谱条件离子源：esi；扫描方式：正离子模式多反应监测(+mrm)；离子源参数：电喷雾电压(is)：5500v；雾化气压力(gs1)：413700pa；辅助气压力(gs2)：413700pa；气帘气压力(cur)：206850pa；离子源温度(tem)：550℃；碰撞气(cad)：7ml/min。监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数见表2。
[0053]
表2监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数
[0054][0055]“*”离子用于定量。电离模式[m+h]
+
。
[0056]
基质效应评价
[0057]
基质效应是影响液相色谱-串联质谱法灵敏度和准确度的主要原因，是样液离子化时样品基质和目标化合物竞争导致的，分基质效应增强和基质效应抑制。本研究通过计算基质混合标液中苦参碱和氧化苦参碱的回收率来评价基质效应，当回收率为100％表示无基质效应，当回收率大于100％表示基质效应增强，当回收率小于100％表示基质效应抑制，回收率偏离100％越远，表明基质效应越显著，偏离100％的差值在
±
20％以内表示基质效应不显著。结果表明：苦参碱平均基质效应为-6.8％；氧化苦参碱平均基质效应为+7.4％，均在
±
10％以内，说明基质效应小，可以忽略基质效应(表3)。
[0058]
表3基质效应评价
[0059][0060]
表中数值为回收率偏离100％的差值。
[0061]
校准曲线和检出限
[0062]
按照上述色谱质谱条件，对混合标准工作溶液系列进行测定，以标准溶液中被测
组分峰面积为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标，绘制校准工作曲线，回归方程和相关系数见表4。结果表明：苦参碱、氧化苦参碱在0.1～50ng/ml范围内有良好的线性关系，相关系数r均大于0.999。另外在空白柞蚕样品中加入低浓度苦参碱、氧化苦参碱标液，制备加标样品，按本文方法进行提取测定并计算其信噪比，以3倍信噪比(s/n＝3)时对应的加标量为最低检出限。由苦参碱、氧化苦参碱的信噪比图3和图4可知：苦参碱最低检出限为0.05μg/kg；氧化苦参碱最低检出限为0.1μg/kg。
[0063]
表4校准曲线的回归分析和方法检出限
[0064][0065]
y—峰面积，x—浓度。
[0066]
精密度和加标回收率
[0067]
空白柞蚕样品，按4个浓度(1.0ug/kg、10ug/kg、40ug/kg、100ug/kg)水平加入苦参碱、氧化苦参碱标准溶液，制备成加标样品，对每个添加水平重复测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差。结果表明，柞蚕中苦参碱的相对标准偏差在1.5％～3.0％之间，回收率在95.4％～118.5％范围内；氧化苦参碱的相对标准偏差在1.7％～3.2％之间，回收率80.2％～87.8％范围内，满足gb/t 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中附录f对精密度、回收率的要求，说明该方法准确、稳定、可靠(表5)。
[0068]
表5精密度及回收率测定结果(n＝6)
[0069][0070]
样品测定
[0071]
将6种柞蚕幼虫(空白对照组健康柞蚕幼虫(编号为kb)，不同浓度苦参碱类农药中毒的4龄柞蚕幼虫(编号为k48-1、k48-2、k96-1)、5龄柞蚕幼虫(编号为k24-1、k24-2))，按上述方法进行检测，结果见表6。由表6可知，中毒蚕样体内均检测出苦参碱残留，且部分蚕样中苦参碱残留量较高。参考gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定：苦参碱每日允许摄入量(adi)为0.1mg/kg bw，但尚未制定苦参碱、氧化苦参碱在蚕类相关产品中的最大残留限量。由于欧盟尚未批准使用苦参碱和氧化苦参碱，规定其最大残留限量小于0.01mg/kg。本次检测中发现有2种中毒蚕样体内的苦参碱含量远超出欧盟规定的最大残留限量值，因此苦参碱和氧化苦参碱的滥用势必导致蚕类相关产品的食品安全隐
患，这就使得开展柞蚕中苦参碱和氧化苦参碱残留检测工作势在必行，一是指导苦参碱、氧化苦参碱的使用浓度和使用范围，为蚕区柞园的合理用药、安全用药提供参考，从而减少或杜绝柞蚕中毒事件发生；二是为开展蚕类相关产品中苦参碱和氧化苦参碱残留风险评估以及最大残留限量值的制定提供方法依据。
[0072]
表6柞蚕样品检测结果
[0073][0074]
以下对比例中，未特别说明的均参照实施例1
[0075]
对比例1
[0076]
离子对的比较：
[0077]
根据苦参碱、氧化苦参碱化合物的性质，采用电喷雾电离正离子模式扫描。针泵进样100ng/ml标准溶液，苦参碱离子化时得到m/z:249.2[m+h]
+
离子作为母离子；氧化苦参碱离子化时得到m/z:265.2[m+h]
+
离子作为母离子。调节碰撞能量(ce)值，将母离子进一步碰碎，苦参碱挑选响应值比较高的m/z:148.3、150.3、176.3、112.2作为子离子；氧化苦参碱选择m/z:247.3、148.2、136.2、205.1作为子离子。按多反应监测(+mrm)组建监测离子对，用ramp进一步优化碰撞气能量ce和去簇电压dp参数。设定离子源参数和液相色谱参数，进样分析10ng/ml混合标准溶液验证所选择的离子对的响应值和稳定性。苦参碱最终选取响应值最高且稳定的离子对q1/q3：249.2/148.3为定量离子对，选择响应值次高且稳定的离子对q1/q3：249.2/150.3为定性离子对；氧化苦参碱选取响应值最高且稳定的离子对q1/q3：265.2/247.3为定量离子对，虽然离子对q1/q3：265.2/136.2、265.2/205.1的响应值均比离子对265.2/148.2的响应值高，但这两对离子对的响应值不稳定且信噪比均不如离子对265.2/148.2的信噪比大，因此选择离子对q1/q3：265.2/148.2为氧化苦参碱的定性离子对。优化的质谱参数详见表2。苦参碱、氧化苦参碱标准溶液的多反应监测(mrm)色谱图见图1，图a为苦参碱离子对249.2/148.3色谱图，图b为苦参碱离子对249.2/150.3色谱图，图c为氧化苦参碱离子对265.2/247.3色谱图，图d为氧化苦参碱离子对265.2/148.2色谱图)。
[0078]
对比例2
[0079]
色谱条件的比较：
[0080]
以2.6μm biphenyl色谱柱(100mm
×
3.0mm)分离，在流速0.4ml/min下分别以0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈、0.1％甲酸水-0.1％甲酸甲醇、0.1％甲酸水-甲醇3种流动相体系，按表1梯度洗脱条件对浓度为10ng/ml混合标准工作溶液进行检测分析，考察流动相对分离效果、峰型及响应值的影响，结果表明：以0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈为流动相，苦参碱和氧化苦参碱两峰的出峰时间过早且两峰没有完全分开；以0.1％甲酸水-甲醇为流动相，相比之下两峰的响应值最小；以0.1％甲酸水-0.1％甲酸甲醇为流动相洗脱，苦参碱、氧化苦参碱的分离度、峰型及响应值均为最好，满足检测要求。苦参碱、氧化苦参碱混合标准工作溶液的总离子流色谱图见图2。
[0081]
对比例3
[0082]
提取方法的比较：
[0083]
提取方法选择根据苦参碱和氧化苦参碱为碱性化合物，分别选用80％乙腈水溶液(含0.2％甲酸)、80％乙腈水溶液(含0.2％氨水)、乙腈、0.2％甲酸乙腈、0.2％氨水乙腈5种溶剂作为提取剂，对加标蚕样(加标量10μg/kg)进行提取，考察5种溶剂对苦参碱、氧化苦参碱的提取效率，结果见表7。由表7数据可知：5种提取剂均对苦参碱有良好的回收率；对氧化苦参碱，只有溶剂80％乙腈水溶液(含0.2％氨水)的提取率达到80％，其余4种溶剂的回收率均≤60％，因此选择80％乙腈水溶液(含0.2％氨水)作为提取溶液。
[0084]
表7不同提取溶剂的回收率
[0085][0086]
分别选用无水硫酸钠和quechers盐试剂作为提取盐，对加标样品采用超声或不超声提取，结果见表8，由表8可知，采用无水硫酸钠作提取盐，超声提取20min，苦参碱和氧化苦参碱的回收率均达80％以上。
[0087]
表8提取盐和提取方式对回收率的影响
[0088][0089]
对比例4
[0090]
净化方法的比较：
[0091]
比较prime hlb plus short(335mg)柱、quechers净化试剂1(内含149.9mg psa，900.1mg硫酸镁)、quechers净化试剂2(内含147.7mg psa，15.1mg gcb，887.2mg硫酸镁)和quechers净化试剂3(内含100mg psa，50mg c18，20mg gcb，400mg硫酸镁)对加标样品(加标量8μg/kg)的净化效果，结果见表9，由表9可知：rprime hlb plus short(335mg)柱对苦参碱有严重的吸附，回收率为25％；对氧化苦参碱完全吸附，回收率为0％；3种quechers净化试剂中只有quechers净化试剂2对苦参碱和氧化苦参碱的回收率均大于80％，故选择quechers净化试剂2用于净化样品。quechers净化试剂1回收率偏低可能因为相比quechers净化试剂2缺少gcb填料，样品中色素没有完全去除而引起基质抑制效应；quechers净化试剂3回收率偏低可能因为相比quechers净化试剂2增加的c18填料对苦参碱和氧化苦参碱有吸附作用。
[0092]
表9不同固相萃取剂对回收率的影响
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对比例5
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浓缩、复溶方法的比较：
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分别在40℃水浴和50℃水浴中氮吹干浓度4ng/ml混合标准溶液，结果表明：50℃水浴中氮吹干，苦参碱和氧化苦参碱的回收率在60％～70％间；40℃水浴中氮吹干，苦参碱和氧化苦参碱的回收率均大于90％，说明40℃水浴中氮吹，苦参碱和氧化苦参碱的损失率很少。
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加标样品(加标量4μg/kg)经提取、净化、浓缩氮吹干后，分别选取20％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)和50％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)作为复溶液，采用超声或不超声进行复溶，其回收率见表10。选用50％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)溶解残渣，超声复溶样品，苦参碱和氧化苦参碱回收率均达80％以上。
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表10不同复溶方法对回收率的影响
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