异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法与流程

异丙托溴铵中杂质
α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法。


背景技术：

2.异丙托溴铵英文名称为ipratropium bromide，别名为[(1r,5s)-8-甲基-8-异丙基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]3-羟基-2-苯基丙酸酯溴化物或溴化异丙托品，是一种可用于治疗支气管扩张的药物，临床上可用于缓解慢性阻塞性肺病引起的支气管痉挛、喘息症状以及防治哮喘，尤适用于因使用β受体激动药产生肌肉震颤、心动过速而不耐受此类药物的患者。其结构式如下：
[0003][0004]
但是在目前生产异丙托溴铵的工艺过程中，很容易残留一种工艺杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯，其cas号为5894-79-1，结构式如下：
[0005][0006]
根据ich m7指导原则，异丙托溴铵原料中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的可接受限度为75.0ppm(ng/mg)，但是常规液相色谱仪的灵敏度并不能满足异丙托溴铵原料中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测要求，目前尚未发现能够准确测定异丙托溴铵原料中较低浓度的杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的含量的检测方法。


技术实现要素：

[0007]
鉴于此，本发明实施例的目的在于提供一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，通过液相色谱-质谱联用技术，实现对异丙托溴铵中较低浓度的杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的准确测定。
[0008]
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
[0009]
一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，采用液相色谱-质谱联用法检测异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯，所述液相色谱-质谱联用法中液相色谱的色谱条件包括：
[0010]
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，
[0011]
流动相：流动相a为含有0.05％～0.20％v/v甲酸的水溶液，流动相b为含有0.05％～0.20％v/v甲酸的乙腈，采用梯度洗脱方式进行洗脱：
[0012]
时间min流动相a％流动相b％
0.1090102.0090109.007～1387～9315.007～1387～9315.10901017.009010
[0013]
总流速：0.55～0.65ml/min。
[0014]
本发明采用特定的液相色谱条件，将异丙托溴铵原料中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯与其他有关物质分离开来，液相色谱仪与质谱仪联用，实现对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的痕量级检测。以该检测方法建立的标准曲线线性良好，线性相关系数可达0.995，回收率在80％～120％之间，具有较高的准确率，且检测限和定量限较低，精密度重现性良好，该检测方法能够对异丙托溴铵中痕量级浓度的杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯准确定量。
[0015]
结合第一方面，所述十八烷基键合硅胶柱的规格为：150
×
4.6mm，填料粒径5μm，色谱柱的长度和填料粒径的大小会直接影响目标物色谱峰的分离效果。
[0016]
结合第一方面，所述十八烷基键合硅胶柱的型号为ymc triart-c18色谱柱。
[0017]
结合第一方面，所述色谱柱柱温为28～32℃，优选为30℃；所述流动相流速为0.60ml/min，选择合适的色谱柱柱温和流动相流速可以使待测物的分离度更好，色谱峰形对称。
[0018]
结合第一方面，所述异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法中，所述液相色谱-质谱联用法中质谱条件包括：
[0019]
离子模式：esi正离子模式，
[0020]
检测模式：mrm多反应检测，
[0021]
气帘气体：30～40l/min，
[0022]
离子化电压：5500～4500v，
[0023]
离子化温度：500～600℃，
[0024]
化合物的检测离子对以及最佳碰撞电压：
[0025][0026]
离子对和碰撞电压为本发明检测方法的关键参数，直接关系到杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯在质谱中的专属性和响应强度。
[0027]
结合第一方面，所述液相色谱-质谱联用法中质谱条件还包括：
[0028]
碰撞气：medium，
[0029]
去簇电压：40～60v，
[0030]
射入电压：5～15v，
[0031]
碰撞室射出电压：5～15volts，
[0032]
离子源气体：50～60psi，
[0033]
辅助加热气：50～60psi。
[0034]
结合第一方面，所述异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法包括以下
步骤：标准样品溶液的配制，利用液相-质谱联用仪，采用标准曲线法，实现异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯含量的准确测定。
[0035]
选取浓度水平较低的标准溶液进行测定并绘制标准曲线，可以更加准确地测定痕量级杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的含量。
[0036]
结合第一方面，所述异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法具体包括以下步骤：
[0037]
步骤a、以甲醇为溶剂配制供试品溶液和所述杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的对照品溶液；
[0038]
步骤b、用所述液相色谱-质谱联用法对所述对照品溶液进行测定，根据峰面积和所述对照品溶液浓度绘制标准曲线；
[0039]
步骤c、用所述液相色谱-质谱联用法对所述供试品溶液进行测定，利用步骤b所得的标准曲线计算所述供试品溶液中α-甲酰基苯乙酸甲酯的浓度。
[0040]
以溶剂甲醇作为空白溶液，甲醇对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的色谱峰无影响，又可以较好地溶解供试品。
[0041]
结合第一方面，所述对照品溶液浓度范围为0.050～1.50μg/ml，在此溶液浓度范围进行测定时，α-甲酰基苯乙酸甲酯的浓度与质谱峰面积之间有最佳的线性关系。
[0042]
第二方面，一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法的应用，该检测方法可实现对异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的准确定量。
[0043]
本发明的有益效果在于：该液相色谱质谱联用法专属性强，线性关系良好，灵敏度高，定量准确可靠，同时具有良好的精密度和耐用性，可用于异丙托溴铵原料中潜在工艺杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的痕量检测，作为对异丙托溴铵原料质量监控的依据。
附图说明
[0044]
图1为杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯对照品溶液的标准曲线；
[0045]
图2为甲醇空白溶液的质谱图；
[0046]
图3为杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯对照品溶液的质谱图；
[0047]
图4为杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯供试品溶液的质谱图；
[0048]
图5为杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯对照品和供试品混合溶液的质谱图。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050]
在以下实施例中：
[0051]
α-甲酰基苯乙酸甲酯购于箴德化工科技(上海)有限公司，纯度为97.9％；
[0052]
质谱仪为ab sciex生产的型号为4000qtrap的质谱仪。
[0053]
实施例1
[0054]
本发明实施例提供一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，以甲醇为溶剂配制对照品溶液和供试品溶液，用液相色谱质谱联用法进行测定。
[0055]
1、液相色谱的测定条件为：
[0056]
色谱柱：ymc triart-c18(4.6mm
×
150mm,填料粒径5μm)，
[0057]
流动相：流动相a为含有0.10％甲酸的水溶液，流动相b为含有0.10％甲酸的乙腈，梯度洗脱条件：
[0058]
时间min流动相a％流动相b％0.1090102.0090109.00109015.00109015.10901017.009010
[0059]
总流速：0.60ml/min，
[0060]
柱温：30℃，
[0061]
进样体积：10μl。
[0062]
2、质谱仪的测定条件为：
[0063]
离子模式：esi正离子模式，
[0064]
检测模式：mrm多反应检测，
[0065]
气帘气体：35l/min，
[0066]
碰撞气：medium，
[0067]
去簇电压：50v，
[0068]
射入电压：10v，
[0069]
碰撞室射出电压：10volts，
[0070]
离子化电压：5000v，
[0071]
离子源气体：55psi，
[0072]
辅助加热气：55psi，
[0073]
离子化温度：550℃，
[0074]
化合物的检测离子对以及最佳碰撞电压：
[0075][0076]
3、对照品溶液和供试品溶液的配制：
[0077]
(1)对照品贮备液：称取杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml约含15μg杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的溶液，作为对照品贮备液，备用；
[0078]
(2)对照品溶液：精密移取对照品贮备液0.5ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液，备用；
[0079]
(3)供试品溶液：称取供试品约100mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液，备用；
[0080]
(4)对照品溶液+供试品溶液：精密移取对照品贮备液0.5ml，再取供试品约100mg，
精密称定，共同置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液+供试品溶液，备用。
[0081]
4、方法学验证：
[0082]
(1)专属性
[0083]
为确定杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯所述方法测定条件下的出峰时间，按照上述液相色谱和质谱条件，依次对上述配制备用的对照品溶液和供试品溶液进行检测，检测结果依次见图2～图5。分析检测结果所得质谱图可知：甲醇作为空白溶液及供试品中其他成分对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的测定无干扰，杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯在供试品中可以正常检出，说明本发明提供的测定方法可以对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯实现定性检测。
[0084]
(2)线性验证
[0085]
称取一定量的α-甲酰基苯乙酸甲酯，精密称定，用甲醇溶解后定容，配制得到每1ml中约含75ng、150ng、300ng、600ng、750ng、1200ng和1500ng的系列标准溶液。按照上述液相色谱和质谱条件进行检测，检测结果见表1。以α-甲酰基苯乙酸甲酯浓度(ng/ml)为横坐标，质谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。标准曲线如图1所示，线性回归方程为：y＝328.59x-420.65，线性相关系数r＝0.9958。
[0086]
表1线性检测结果
[0087][0088]
(3)检测限
[0089]
量取一定体积上述对照品溶液，用甲醇逐级定量稀释，按照上述液相色谱和质谱条件进行检测。经检测，按照信噪比不低于3:1，得到溶液检测限为37.59ng/ml，折算到供试品中检测限为0.376ng/mg。
[0090]
(4)定量限
[0091]
量取一定体积上述对照品溶液，用甲醇逐级定量稀释，按照上述液相色谱和质谱条件进行检测。经检测，按照信噪比不低于10:1，得到溶液定量限为75.17ng/ml，折算到供试品中定量限为0.752ng/mg。
[0092]
分别平行制备定量限浓度溶液6份(溶液1～溶液6)，按照上述液相色谱和质谱条件对该6份溶液进行检测，分析定量限精密度，结果见表2。
[0093]
表2定量限浓度溶液重复性检测结果
[0094][0095]
由表1可以看出，上述6次平行测定的相对标准偏差为5.64％，满足检测要求，说明采用所述液相色谱和质谱法联用技术可以对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯实现痕量级别的定量测定。
[0096]
(5)重复性
[0097]
量取上述供试品溶液，制备6份平行样品(1～6)，按照上述液相色谱和质谱条件对该6份平行样品进行检测，检测结果见表3。
[0098]
表3重复性检测结果
[0099][0100]
由表3检测结果可知，6份平行供试品溶液结果均为未检出，表明本发明检测方法的重复性良好。
[0101]
(6)精密度
[0102]
量取上述对照品溶液，制备6份平行样品(1～6)，按照上述液相色谱和质谱条件对该6份平行样品进行检测，检测结果见表4。
[0103]
表4精密度检测结果
[0104][0105]
由表4检测结果可知，6份平行对照品溶液所对应峰面积的相对标准偏差为2.49％，满足本领域精密度相对标准偏差小≤10％的要求，说明本发明检测方法的精密度良好。
[0106]
(7)准确度
[0107]
杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的准确度试验以下述回收率(％)表示。
[0108]
按照下述配制方法分别量取不同体积的上述对照品溶液，分别与一定量供试品混合，配制得到低浓度加标、中浓度加标和高浓度加标三种不同浓度的供试品加标溶液，具体配制方法如下：
[0109]
低浓度加标溶液(80％限度回收率溶液)：准确移取对照品贮备液0.4ml于10ml容量瓶中，再加入约10mg供试品，用甲醇稀释至刻度，平行制备三份；
[0110]
中浓度加标溶液(100％限度回收率溶液)：准确移取对照品贮备液0.5ml于10ml容量瓶中，再加入约10mg供试品，用甲醇稀释至刻度，平行制备三份；
[0111]
高浓度加标溶液(160％限度回收率溶液)：准确移取对照品贮备液0.8ml于10ml容量瓶中，再加入约10mg供试品，用甲醇稀释至刻度，平行制备三份。
[0112]
按照上述液相色谱和质谱条件对上述三种不同浓度的供试品加标溶液进行检测，检测结果见表5，按照公式分别计算加标回收率：加标回收率(％)＝(回收量-本底量)/加标量
×
100％。
[0113]
表5准确度检测结果
[0114][0115][0116]
由表5结果可知，杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯在80％～160％限度浓度范围内，回收率在91.85～94.79％之间，说明本发明检测方法准确度良好。
[0117]
实施例2
[0118]
本发明实施例提供一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，本实施例主要考察该检测方法对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的耐用性。
[0119]
对实施例1中的色谱条件从流速、柱温和流动相三个方面进行微调，分别按照微调后的检测条件对上述对照品溶液进行检测，检测结果见表6。
[0120]
表6耐用性检测结果
[0121][0122]
由表6可知，微调液相色谱的色谱条件对杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测基本无影响，说明该检测方法有着良好耐用性。
[0123]
实施例3
[0124]
本发明实施例提供一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，本实施例主要考察该检测方法的中间精密度，即该实施例与实施例1(5)重复性检测的检测日期不同、检测人员不同，但液相色谱和质谱条件均与实施例1相同。
[0125]
量取上述供试品溶液，制备6份平行样品，按照与实施例1相同的检测条件对该6份平行样品进行检测，检测结果见表7。
[0126]
表7中间精密度检测结果
[0127][0128]
由表7可知，由供试品溶液制备的6份平行样品检测结果均为未检出，与实施例1
(5)重复性的检测结果一致，说明该检测方法的中间精密度性良好。
[0129]
实施例4
[0130]
本发明实施例提供一种异丙托溴铵中杂质α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测方法，本实施例主要考察该检测方法中所用溶液的稳定性。
[0131]
将上述对照品溶液和供试品溶液均置于室温下静置，并且每隔0h、2h、4h、6h、8h和24h分别对其按照实施例1中的检测条件进行检测，对照品溶液和供试品溶液经过不同静置时间的检测结果分别见表10和表11。
[0132]
表10对照品溶液稳定性检测结果
[0133][0134]
表11供试品溶液稳定性检测结果
[0135][0136]
由表10的检测结果可以看出，对照品溶液在室温条件下，静置0-24h，静置不同时间的α-甲酰基苯乙酸甲酯的质谱峰面积的相对标准偏差为5.69％，满足≤10％的要求；由表11的检测结果可以看出，供试品溶液在室温条件下，静置0-24h，静置不同时间的供试品溶液中α-甲酰基苯乙酸甲酯的检测结果均为未检出；表10和表11的检测结果说明该检测方法所用溶液的稳定性良好。
[0137]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。