一种鉴别防风与水防风的检测方法与流程

1.本发明涉及防风鉴别技术领域，特别是涉及一种鉴别防风与水防风的检测方法。


背景技术：

2.防风为伞形科植物防风的干燥根，性味辛、甘，微温，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。主要用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风的治疗。防风药用历史悠久，《神农本草经》将其列为上品，《古代经典名方目录(第一批)》中，汉方“桂枝芍药知母汤”、唐方“小续命汤”和宋方“辛夷散”等10首名方均有使用防风。研究发现，防风的药理活性成分主要分为香豆素、色原酮、多糖和挥发油四类。
3.防风为大宗药材，流通量大，产地繁多。野生品主要分为关防风、口防风和西北防风，以内蒙古、黑龙江、甘肃等省份为主产区。栽培品因河北地区栽培早且量大，又被称为冀防风，以河北、山西、陕西等省份为主产区。随着市场需求逐年增大，野生防风资源日渐匾乏，交易价格居高不下。调研发现，市场中存在水防风、川防风和云防风等混淆品冒充防风的现象，其中又以水防风较多。水防风为宽萼岩风的干燥根，解表功效略逊于防风，但毒性较防风强，临床应慎用。
4.目前，防风法定检验标准为2020年版《中国药典》，对样品的6方面理化指标做出限度值规定，包括性状、显微、薄层鉴别、水分、总灰酸灰、升麻素苷和5-o-甲基维斯阿米醇苷的含量。水防风检验标准为1991年版《河南中药材标准》，仅检测性状和显微，质量品质难以控制。按防风的标准进行水防风的检验，结果水防风的外观性状、显微特征、含量控制指标均符合标准要求，两者之间的差异性极不明显，现行标准难以用于区分防风的真伪，容易出错。
5.查阅国内外文献，发现至今仅有《基于hplc指纹图谱的防风与其伪品水防风的鉴别研究》和《基于高效液相指纹图谱和化学计量法的防风药材及其伪品的鉴别》2篇文献，以液相色谱法对防风所含化合物进行了简单分析，且都存在两方面缺陷：一方面，液相色谱是基于特定紫外波长采集化合物的信息，改变紫外波长会出现完全不同的指纹图谱；另一方面，文献均未明确特定化合物成分，用于快速筛选区分真伪防风，指纹图谱的分析存在耗费时间长，标准指纹图谱建立、获取困难等问题，难以作为法定质量标准应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种鉴别防风与水防风的检测方法，从化学成分角度建立防风与水防风辨识的新方法，该方法灵敏、准确、可靠，可用于防风的质量控制。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种鉴别防风与水防风的检测方法，包括以下步骤：
9.(1)供试品溶液的制备：分别取等量的多批确切来源的防风和水防风样品粉末，各样品粉末中分别加入甲醇，称定重量，超声处理后放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减
poroshell120ec-c
18
的色谱柱，流动相：乙腈-0.1％甲酸溶液，柱温30℃，流速0.5ml
·
min-1
；
22.质谱条件为电喷雾离子化源，采集模式为正离子模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为5l/min，雾化器压力为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11l/min，毛细管电压为3500v，喷嘴电压为500v，质量扫描范围为50～1000m/z，碎裂电压为135v。
23.pca分析的具体方法为：将质谱原始数据导入mpp数据处理软件，使用峰匹配、峰对齐、噪声过滤的筛选方法，提取特征峰的数据；再以p值小于0.05的t检验统计学算法为基础，对特征峰进行主成分分析；最后，将第一、第二、第三主成分要素统计结果，依次编为x轴、y轴和z轴，建立30批供试品的3d结构模型，观察防风与水防风之间的差异。
24.差异性标志物分离纯化的具体方法为：取其中一批水防风供试品粉末1kg，加入95v/v％甲醇3l并浸泡，超声处理，滤过，减压浓缩提取液至干，得到棕褐色油状浸膏，使用硅胶柱层析法对其进行分离，得到高纯度差异性标志物。
25.所述硅胶柱层析法具体为：首先以三氯甲烷/甲醇溶剂系统按95∶5
→
50∶50的梯度洗脱，收集75％三氯甲烷/甲醇洗脱的馏分fr.a；再以正己烷/乙酸乙酯溶剂系统按75∶25
→
30∶70的梯度洗脱馏分fr.a，收集55％正己烷/乙酸乙酯洗脱的馏分fr.b；最后使用制备液相对馏分fr.b进行纯化，流动相为体积比为40:60的乙腈-水，流速为3.0ml
·
min-1，得到高纯度差异性标志物。
26.差异性标志物质谱鉴定的具体步骤为：取步骤(5)制得的高纯度差异性标志物，加入甲醇制成标志物溶液，采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪采集二级质谱碎片图；质谱、色谱条件与步骤(2)相同。
27.采用液相色谱仪检测的待测样品溶液的具体制备方法为：取待测样品粉末1g，加入70v/v％甲醇50ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
28.采用高效液相色谱-质谱联用仪检测的待测样品溶液的具体制备方法为：取待测样品粉末0.2g，加入70v/v％甲醇100ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
29.采用液相色谱仪检测待测样品溶液的方法为：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定，得到液相色谱图；
30.色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为70：30的乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；采用二极管阵列检测器，检测波长为222nm。
31.采用高效液相色谱-质谱联用仪检测待测样品的方法为：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定；
32.色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱内径2.1mm；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，流速为每分钟0.3ml；
33.质谱条件为：采用电喷雾正离子模式，多反应监测，选择m/z 427.2
→
245.1和m/z427.2
→
327.1作为检测离子对。
34.本发明的有益效果是：一方面，使用hplc-q-tof-ms技术对防风与水防风进行统计学分析，建立了两者的差异性pca模型，并对不同产地的样品进行了聚类分析，统计结果不仅有效鉴别了防风与水防风，还明确了野生和栽培防风的内在差异。另一方面，对水防风中
的特有成分差异性标志物进行了分离纯化，并通过质谱和核磁的手段鉴定其化学结构，确定其为xanthalin，使其可以作为标准对照物质，解决防风中掺杂水防风的问题，本发明两方面研究的有效结合，能够快速而全面的控制防风的质量，为防风的补充检验标准起草提供了依据。
附图说明
35.图1为防风(s10)与水防风(s1)的总离子流图(a防风、b水防风)；
36.图2为防风与水防风的pca得分图；
37.图3为防风与水防风的聚类树状图；
38.图4为防风与水防风的差异化合物图；
39.图5为防风与水防风的提取离子流图(c防风、d水防风)；
40.图6为高纯度差异性标志物的液相色谱图；
41.图7为标志性差异物的二级质谱图；
42.图8为标志性差异物的裂解途径；
43.图9为xanthalin的核磁
13
c碳谱图；
44.图10为xanthalin的核磁1h氢谱图；
45.图11为xanthalin的立体化学结构式；
46.图12为实施例1的差异性标志物xanthalin与待测样品的液相色谱对照图；
47.图13为实施例2的差异性标志物xanthalin与待测样品的液相色谱对照图；
48.图14为实施例2的差异性标志物xanthalin与待测样品的光谱对照图；
49.图15为实施例3的差异性标志物xanthalin的总离子流与提取离子流图；
50.图16为实施例3的待测样品的总离子流与提取离子流图；
51.图17为实施例4的差异性标志物xanthalin的总离子流与提取离子流图；
52.图18为实施例4的待测样品的总离子流与提取离子流图。
具体实施方式
53.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述：
54.实施例1
55.仪器：
56.1260高效液相色谱仪(美国agilent公司)，6530四极杆-飞行时间串联质谱仪(美国agilent公司)，lc-20ap制备液相色谱仪(日本shimadzu公司)，jnm-ecz400s核磁共振仪(日本jeol公司)，xpe26百万分之一电子天平(瑞士mettlertoledo公司)，zm-200超离心碾磨仪(德国retsch公司)，r-300旋转蒸发仪(瑞士buchi公司)，fesco17微量离心机(美国thermofisher公司)，ua22mfd数控型超声波仪(德国wiggens公司)，advantagea10超纯水器(美国millipore公司)。
57.试药：
58.乙腈、甲酸(均为质谱级，购于cnw)；甲醇(色谱级，购于tedia)；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯(均为分析级，购于国药集团化学试剂有限公司)；氘代氯仿(氘代度99.8+％，核磁共振用，购于merck)；柱层层析硅胶(购于macklin)；超纯水。
59.鉴别防风与水防风的检测方法，具体包括以下步骤：
60.(1)供试品溶液的制备：分别取防风和水防风样品粉末各1g，精密称定，分别加入70v/v％甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，超高速离心，各取上清液，即得各供试品溶液。
61.样品防风采自内蒙古、黑龙江、河北等地，分为野生品和栽培品，样品水防风采自河南和山西，均为野生品。防风按2020年版《中国药典》一部，水防风按1991年版《河南中药材标准》鉴定。具体信息详见表1，其中对照药材：防风(批号：120947-201810)、水防风(批号：121349-202002)均购于中国食品药品检定研究院(表中简称中检院)；野生品在名称后添加“*”标识。
62.表1防风与水防风的信息
[0063][0064][0065]
本步骤中，液质提取溶剂的选择使用甲醇、70％甲醇、30％甲醇分别提取供试品，结果70％甲醇提取液的特征峰数量、峰形和峰面积最优，获得的化合物信息更全面，故选70％甲醇作为提取溶剂。比较了超声时间10、30、60min对结果的影响，超声10分钟时，各组
分含量偏低，超声时间超过30min后，各组分含量基本不变，故选30min作为提取时间。
[0066]
(2)样品分析：分别取步骤(1)制备的供试品溶液各1μl，采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分别采集供试品溶液的总离子流图。防风与水防风对照药材测得的总离子流图详见图1。
[0067]
液相条件为：色谱柱：agilentporoshell120ec-c
18
柱(4.6mm
×
50mm，2.7μm)，流动相：乙腈-0.1％甲酸溶液(梯度洗脱，详见表2)，柱温30℃，流速0.5ml
·
min-1
。
[0068]
表2梯度洗脱方法
[0069][0070]
质谱条件为：电喷雾离子化源(esi)，采集模式为正离子模式，干燥气温度：300℃，干燥气流速：5l/min，雾化器压力：35psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3500v，喷嘴电压：500v，质量扫描范围m/z：50～1000，碎裂电压：135v。
[0071]
本发明比较了甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙睛-水、乙睛-0.1％甲酸水溶液4种流动相的分析效果，结果用乙睛-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱时，各共有峰峰形最好，分离度较高，故选乙睛-0.1％甲酸水溶液作为流动相。
[0072]
(3)pca分析和聚类分析：将步骤(2)所得的质谱原始数据导入mpp数据处理软件，提取特征峰数据，对特征峰进行主成分分析和聚类分析；
[0073]
主成分分析(pca)：将质谱原始数据导入mass profiler professional(mpp)数据处理软件，使用峰匹配、峰对齐、噪声过滤的筛选方法，提取特征峰的数据。再以t检验(p值小于0.05)的统计学算法为基础，对特征峰进行主成分分析。最后，将第一、第二、第三主成分要素统计结果，依次编为x轴、y轴和z轴，建立30批供试品的3d结构模型，观察防风与水防风之间的差异，结果详见图2。总体来看，21批防风聚集在x轴的上方，9批水防风聚集在x轴的下方，两者得到了显著性区分。
[0074]
聚类分析：使用mpp软件对特征峰进行聚类分析，通过观察不同供试品的分类情况，分析品种和产地对化合物组成的影响。结果在聚类树状图(图3)中，防风与水防风的差异性十分明显，30个样本分为2类，s1～s9归类为水防风，s10～s30归类为防风，与pca分析结果保持一致。其中，21批防风又按野生品和栽培品的不同分为2类，s10～s12和s16～s18归为一类，为野生品，其余15批归为一类，为家种的栽培品。聚类树状图的结果与外观性状和产地信息基本一致，可以作为鉴别防风真伪和产地的有效方法。
[0075]
(4)差异性标志物的筛选：使用mpp软件的查找特征化合物功能，将防风和水防风分为两组，根据化合物响应值筛选组间的差异化合物，结果获得防风差异性标志物2个，水防风差异性标志物6个，共有化合物18个，结果详见图4。分别解析8个差异性标志物的提取
gracilis[j].nat prod res dev(天然产物研究与开发),2003,15(3):196-198.)，最终确定该化合物的分子式为c
24h26
o7，结构式为
[0084]
表3 xanthalin的1h氢谱和
13
c碳谱核磁数据
[0085][0086]
(6)对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：取差异性标志物xanthalin适量，精密称定，加70v/v％甲醇制成每1ml含20μg差异性标志物的溶液，即得。
[0087]
(7)待测样品溶液的制备：取1号待测样品粉末(过四号筛)1g，加入70v/v％甲醇
50ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为1号测样品溶液。
[0088]
(8)检测与判定：分别吸取对照品溶液与1号待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定，得到液相色谱图；
[0089]
若待测样品溶液的液相色谱图中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，判定待测样品为防风；色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(70：30)为流动相；采用二极管阵列检测器，检测波长为222nm。理论板数按xanthalin峰计算应不低于3000。
[0090]
若待测样品溶液的液相色谱图中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上出现相同的色谱峰，则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在190～400nm波长范围内的紫外-可见吸收光谱，若紫外-可见吸收光谱不相同，则判定待测样品为防风，若紫外-可见吸收光谱相同，则判定待测样品掺杂水防风。
[0091]
由图12可知，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，判定待测样品为防风。
[0092]
实施例2
[0093]
按实施例1中方法鉴别防风与水防风，不同之处在于：对2号待测样品粉末进行检测与判定。
[0094]
由图13中可知，图13中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上出现相同的色谱峰，由图14可知，相应色谱峰在190～400nm波长范围内紫外-可见吸收光谱相同，判定待测样品掺伪了水防风。
[0095]
实施例3
[0096]
按实施例1中方法鉴别防风与水防风，不同之处在于：步骤(7)、(8)改为：
[0097]
(7)待测样品溶液的制备：取3号待测样品粉末(过四号筛)0.2g，加入70v/v％甲醇100ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
[0098]
采用高效液相色谱-质谱联用仪检测待测样品的方法为：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定；
[0099]
色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱内径2.1mm；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，流速为每分钟0.3ml；
[0100]
(8)检测与判定：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪进行测定，得到提取离子流色谱；
[0101]
若待测样品溶液的提取离子流色谱中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，则判定待测样品为防风，反之则判定待测样品掺杂水防风。
[0102]
色谱、质谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，按表5中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式(esi
+
)，多反应监测(mrm)，选择m/z 427.2
→
245.1和m/z 427.2
→
327.1作为检测离子对。理论板数按xanthalin峰计算应不低于3000。
[0103]
表5梯度洗脱程序
[0104][0105]
对比图15、16可知，待测样品溶液的提取离子流色谱中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，判定待测样品为防风。
[0106]
实施例4
[0107]
按实施例3中方法鉴别防风与水防风，不同之处在于：对4号待测样品粉末进行检测与判定。
[0108]
对比图17、18可知，待测样品溶液的提取离子流色谱中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上出现了相同的色谱峰，判定待测样品掺伪了水防风。
[0109]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。