VWF糖基化蛋白的检测试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途

vwf糖基化蛋白的检测试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途
技术领域
1.本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及vwf糖基化蛋白的检测试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途。


背景技术：

2.肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。
3.肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。
4.肺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前及时发现肺癌。如果可以找到血浆或其外泌体里面的肺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。
5.vwf蛋白(uniprotkb编号为:p04275)是一种大分子量的多亚基糖蛋白，由多个220kd的亚基组成。一方面，vwf可以介导血小板粘附于受损的血管壁，形成血栓得以止血；另一方面，正常情况下，vwf与人凝血因子viii基因(hfviii)在血浆中紧密结合形成稳定的复合物，vwf复合物的形成在体内阻碍了可能由细胞表面受体介导的hfviii分解，对维持hfviii的半衰期至关重要。糖基化(glycosylation)是一种重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式。目前尚未见vwf糖基化蛋白与肺癌相关的报道。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的在于提供vwf糖基化蛋白的检测试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途。
7.本发明的第二个目的在于提供检测vwf糖基化蛋白的仪器在制备筛查患肺癌风险的设备中的用途。
8.本发明的第三个目的在于提供一种新的筛查患肺癌风险的试剂盒或设备。
9.本发明提供了检测vwf糖基化蛋白的试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途。
10.进一步地，所述vwf糖基化蛋白为vwf蛋白的第2357位点上发生n-糖基化修饰后的产物。
11.进一步地，所述检测vwf糖基化蛋白的试剂为检测人血浆中vwf糖基化蛋白的试剂。
12.进一步地，所述检测vwf糖基化蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或western blot试剂。
13.本发明还提供了检测vwf糖基化蛋白的仪器在制备筛查患肺癌风险的设备中的用途。
14.进一步地，所述vwf糖基化蛋白为vwf蛋白的第2357位点上发生n-糖基化修饰后的产物。
15.进一步地，所述检测vwf糖基化蛋白的仪器为检测人血浆中vwf糖基化蛋白的仪器。
16.进一步地，所述检测vwf糖基化蛋白的仪器为液相色谱-质谱联用仪。
17.本发明还提供了一种筛查患肺癌风险的试剂盒或设备，它包括用于检测vwf糖基化蛋白的试剂或仪器。
18.进一步地，所述vwf糖基化蛋白为vwf蛋白的第2357位点上发生n-糖基化修饰后的产物。
19.本发明通过质谱蛋白组学方法鉴定发现vwf蛋白的第2357位点上能够发生n-糖基化修饰。
20.蛋白质糖基化按照氨基酸和糖的连接方式可以分为四类：o位糖基化、n位糖基化、c位甘露糖化以及gpi(glycophosphatidlyinositol)锚定连接。其中，n位糖基化(n-linked glycosylation，简称n-糖基化)是通过糖链的还原端n-乙酰胺基葡萄糖(glc-nac)和肽链中某些asn侧链酰胺基上的n原子相连，能接有糖链的asn必须处于asn-x-ser/thr(x！＝p)残基构成的基序中。糖为n-乙酰葡糖胺。
21.本发明的关键在于，确定了人体血浆中vwf糖基化蛋白水平与患肺癌的风险显著相关，因此可以通过检测人体血浆中vwf糖基化蛋白水平来判断患肺癌的风险，至于具体检测人体血浆中vwf糖基化蛋白水平的手段，可以采用现有技术公开的各种手段，本发明实施例具体采用液相色谱-质谱联用分析法进行检测，单不仅仅限于该手段，任何能够检测人体血浆中vwf糖基化蛋白水平的方法均可用于肺癌筛查。
22.本发明提供了一种新的肺癌筛查标记物和一种新的肺癌筛查试剂盒，可以筛查待检人群患肺癌的风险，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。且能以血浆作为检测样品，对患者伤害很低。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1：肺癌患者(lc)与健康人群(nc)血浆中vwf糖基化蛋白水平对比图。
26.图2：肺癌患者(lc)与健康人群(nc)的roc分析。
具体实施方式
27.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
28.实施例1：vwf糖基化蛋白的检测试剂在制备筛查患肺癌风险的试剂盒中的用途
29.1.检测原理
30.糖基化是一种重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式。血浆n-糖基化检测原理为：提取血浆全蛋白，经胰酶酶解后形成的肽段使用亲水作用色谱富集n糖基化肽段，再用n-糖酰胺酶f(pngase f)在h2o
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中切除糖链，使得糖基化修饰过的位点引入o
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，分子量的增加使得在液质联用系统中能够轻松辦别出该位点，从而确定n-糖基化发生的位点。
31.2.检测方法
32.(1)蛋白提取
33.表1.样品来源人群信息
34.人群人数肺癌患者20健康人群20
35.样品来源于肺癌患者和健康人群血浆，受试人群的年龄范围为29～82岁，男性占32.5％，女性占67.5％。
36.样品从-80℃取出，4℃，12000g离心10min，去除红细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
37.(2)胰酶酶解
38.各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致，加入适量标准蛋白，再加入二硫苏糖醇(dtt)使其终浓度为5mm，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(iaa)使其终浓度为11mm，室温避光孵育15min。将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12000g离心20min，用8m尿素置换3次，再用置换buffer置换尿素3次，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。室温12000g离心10min回收肽段，再用超纯水回收肽段一次，合并两次肽段溶液。
39.(3)tmt标记
40.胰酶酶解的肽段用strata x c18(phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5m teab溶解肽段，根据tmt试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。
41.(4)hplc分级
42.肽段用高ph反相hplc分级，色谱柱为agilent 300extend c18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、ph 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为4个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
43.(5)修饰富集
44.将肽段溶解在200μl富集缓冲溶液中(80％乙腈/5％三氟乙酸)，转移上清液至亲水(hilic)微柱中，1000g离心约15min完成富集。接着使用富集缓冲液洗涤亲水微柱3次。然后使用分别使用0.1％三氟乙酸，50mm碳酸氢铵溶液和50％乙腈洗脱糖肽，收集合并洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后复溶在50μl重氧水溶解的50mm碳酸氢铵缓冲液中，并加入2μlpngase f糖苷酶(植物样本复溶在50μl重氧水溶解的50mm柠檬酸钠缓冲液中，并加入2μlpngase a和pngase f糖苷酶)，37℃酶切过夜。最后，按照c18ziptips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析。
45.(6)液相色谱-质谱联用分析
46.肽段用液相色谱流动相a相溶解后使用easy-nlc 1200超高效液相系统进行分离。流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相b为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-38min，4％～20％b；38-54min，20％～32％b；54-57min，32％～80％b；57-60min，80％b，流速维持在500nl/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入nsi离子源中进行电离然后进q exactive
tm hf-x质谱进行分析。离子源电压设置为2.1kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1400m/z，扫描分辨率设置为120000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为30000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(dda)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入hcd碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(agc)设置为1e5，信号阈值设置为1e5 ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15s秒避免母离子的重复扫描。
47.3.检测结果
48.本发明通过前述质谱蛋白组学方法鉴定发现vwf蛋白的第2357位点上能够发生n-糖基化修饰，且该n-糖基化修饰水平在肺癌患者和健康人群之间有显著性差异。
49.表2.不同人群血浆vwf糖基化蛋白水平的检测结果
[0050][0051]
根据表2和图1可以看出，与健康人群相比，肺癌患者血浆中的vwf糖基化蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(p《0.01)。
[0052]
根据roc曲线(图2)可以看出，roc曲线下面积为76.8，说明通过检测血浆中vwf糖基化蛋白水平来筛查或诊断肺癌患者的方法具有优良的准确度、敏感度和特异性。
[0053]
综上，本发明首次发现，与健康人群相比，肺癌患者血浆中的vwf糖基化蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(p《0.01)。说明通过检测血浆中vwf糖基化蛋白水平，可以筛查待检人群患肺癌的风险：若vwf糖基化蛋白水平低(相对于健康人群而言)，则患肺癌的风险高，若vwf糖基化蛋白水平高(相对于健康人群而言)，则患肺癌的风险低。可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。