一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷B2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒与流程

一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。
技术背景
2.11-脱氢血栓烷b2(11-dehydro-thromboxane b2，11dhtxb2)是血栓烷素a2(thromboxane a2，txa2)的终末代谢产物，主要经肾排出。血栓烷素a2(txa2)是一种前列腺素的代谢产物，在止血和心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。txa2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体(tpr)激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。但是txa2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素b2(thromboxane b2，txb2)。txb2随后在肝中被转化为半衰期更长的11-脱氢血栓烷素b2(11dhtxb2)，并经尿液排出。体外血小板激活会明显影响血清txb2的测定结果，却对血清11dhtxb2水平无影响，同时尿液与血清中11dhtxb2的浓度有良好的相关性，因而测定尿液11dhtxb2的含量能更有效的反映体内txa2的产生。
3.目前，已报道的11dhtxb2的检测方法有放射性免疫法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、气相色谱-串联质谱法(gc-ms)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)。市面上的商业化试剂盒多采用elisa法测定，包括第一代基于多克隆抗体的elisa试剂盒和第二代基于单克隆抗体的elisa试剂盒，但第一代试剂盒已被停用。第二代试剂盒所使用的单克隆抗体会与另一种txa2的代谢产物，11-脱氢-2,3-dinor-血栓烷素b2(11-dh-2,3-dinor-txb2)产生交叉反应，显著影响检测结果，使检测值存在较大变异性，降低了第二代elisa试剂盒的准确性和临床实用性。此外，市面上的11dhtxb2试剂盒检测范围窄(300～4000pg/ml)，对人尿液中更高和/或更低水平的11dhtxb2不能准确测定。gc-ms测定尿液中11dhtxb2，前处理过程极其复杂，包括提取、衍生和富集过程，检测时间长，目前只应用于科研领域。lc-ms/ms是一种采用液相色谱分离、质谱检测的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。采用固相萃取法可有效去除待测物干扰物并进行富集，以提高方法灵敏度。由于11dhtxb2为小分子代谢物，且在尿液中影响其浓度的因素多，测得的尿11dhtxb2浓度需用尿肌酐浓度进行校正，以排除尿液浓度和肾功能的影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法和试剂盒。该方法先加入稳定剂提高尿液样本的稳定性，再用酸化剂调节尿液ph，孵育一段时间后，采用特异性固相萃取材料，高效富集尿液中的11-脱氢血栓烷b2(11dhtxb2)，有效去除尿液中基质的干扰，实现对11-脱氢血栓烷b2(11dhtxb2)的精准检测。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种尿液中11-脱氢血栓烷b2的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标液、校准液、稀释液、稳定剂、酸化剂、活
化液、平衡液、淋洗液1和2、洗脱液和质控样本。
6.优选的所述特异性固相萃取柱是以硅胶为基质的含有苯基或c4～c18的正构烷基的亲和材料。
7.优选的所述校准液为用乙腈配制的9个浓度的溶液；其浓度范围为为0.5～100ng/ml。
8.优选的所述内标为11dhtxb
2-d4，其浓度为5～50ng/ml。
9.优选的所述稀释液为ph2.0～4.0的pbs溶液。
10.优选的所述稳定剂为抗坏血酸、柠檬酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽中的一种或几种，其质量分数为0.01％～20％的水溶液。
11.优选的所述酸化剂为含10％～50％浓盐酸的水溶液。
12.优选的所述活化液为甲醇、乙腈或乙醇。
13.优选的所述平衡液和淋洗液1、淋洗液2为水和有机试剂(甲醇、乙腈或乙醇)的混合溶液，
14.其体积比为(60～100)％：(40～0)％；有机试剂为甲醇、乙腈或乙醇。
15.优选的所述洗脱液为按体积比计含1％～10％甲酸的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。
16.一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2(11dhtxb2)的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)
17.方法，包括以下步骤：
18.(1)尿液样本与稳定剂混匀，加入酸化剂，使其ph在2.0～4.0之间；
19.(2)经酸化的尿液样本于25℃～45℃孵育1h～4h后，加入内标液混合，离心；
20.(3)特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入离心好的尿液样本上清液，使用淋洗液进行淋洗，最终用洗脱液洗脱并收集；
21.(4)将步骤(3)得到的洗脱液采用液相色谱串联质谱分析，通过校准液建立的校准曲线计算尿液样本中11-脱氢血栓烷b2的含量。
22.优选的，步骤(4)中的色谱条件：色谱柱：waters，cortecs t3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μl；流动相：(a)5mmol/l甲酸铵的水溶液，(b)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
[0023][0024][0025]
质谱条件：离子化模式：esi-；喷雾电压：-4500v；温度：500℃；雾化气gs1：55psi；
辅助雾化气gs2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(mrm)；
[0026][0027]
注：*为定量离子。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
1、本发明使用的尿液样本，无创伤性、对患者要求低，有利于临床样本的采集；
[0030]
2、本发明提供的稳定剂，可有效延长尿液样本的稳定时间，有利于尿液样本的运输、储存；
[0031]
3、本发明提供的前处理方法，孵育过程可有效将11-脱氢血栓烷b2开环转化为闭环形式，并去除杂质，实现对人尿液11-脱氢血栓烷b2的精准检测；
[0032]
4、本发明提供的测定方法，操作简单可靠，分析时间短，有利于高通量测定临床样本；
[0033]
5、本发明为首个基于液质方法开发的11-脱氢血栓烷b2检测试剂盒，准确度高、特异性强，检测范围宽，易于临床推广和应用。
附图说明
[0034]
图1为尿液中11dhtxb2和11dhtxb
2-d4的色谱图。
具体实施方式
[0035]
下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0036]
实施例1：一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的试剂盒。
[0037]
一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的试剂盒，其组成见下表：
[0038]
名称成分固相萃取柱特异性固相萃取柱校准液乙腈配制的9个浓度的11dhtxb2的校准品稀释液pbs溶液(ph 3.0)稳定剂0.01％谷胱甘肽水溶液酸化剂20％浓盐酸活化液甲醇平衡液水淋洗液1水淋洗液210％甲醇洗脱液3％甲酸甲醇
质控样本2个浓度的11dhtxb2尿液样本内标液浓度为10ng/ml的11dhtxb
2-d4溶液
[0039]
其中，校准液中11dhtxb2浓度见下表：
[0040]
序号123456789浓度ng/ml0.51248204075100
[0041]
实施例2一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法
[0042]
该发明的检测方法主要包括以下主要步骤：
[0043]
1、基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷b2提取过程
[0044]
(1)5ml尿液加入50μl稳定剂，混匀，用酸化剂调节ph至2.0～4.0；
[0045]
(2)取(1)尿液500μl于35℃孵育3h，加入50μl内标液混匀，振荡5分钟，离心；
[0046]
(3)特异性固相萃取柱(固相萃取材料是以硅胶为基质的含有c18的正构烷基，规格50mg/1ml)用300μl活化液活化、300μl平衡液平衡，加入上清液样本后，用300μl淋洗液1和淋洗液2进行淋洗，最终采用150μl洗脱液洗脱，收集。
[0047]
2、液质分析条件
[0048]
(1)检测设备：ab sciex triple quad 4500md液相色谱串联质谱仪
[0049]
(2)色谱条件：
[0050]
色谱柱：waters，cortecs t3；柱温：40℃；进样室温度：10℃；进样量：5μl；流动相：(a)5mmol/l甲酸铵的水溶液，(b)乙腈溶液；梯度洗脱条件：
[0051][0052][0053]
(3)质谱条件：
[0054]
离子化模式：esi-；喷雾电压：-4500v；温度：500℃；雾化气gs1：55psi；辅助雾化气gs2：55psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(mrm)；
[0055][0056]
注：*为定量离子。
[0057]
3、检测结果计算
[0058]
采用校准曲线法计算尿液中11-脱氢血栓烷b2的浓度。取50μl校准溶液加入450μl稀释液混合，按照步骤1中“基于试剂盒产品的11-脱氢血栓烷b2提取过程”项进行样品处理后，进行液质分析。根据各物质峰面积as和相应内标峰面积ai的比值f(f＝as/ai)对浓度c进行权重线性回归，拟合校准曲线，权重为1/c2(c为浓度值，单位：ng/ml)。尿液中11-脱氢血栓烷b2同其内标测得的峰面积之比代入校准曲线，计算尿液中11-脱氢血栓烷b2的浓度。
[0059]
表1.lc-ms/ms法测定11-脱氢血栓烷b2结果分析
[0060][0061]
实施例3一种用于检测尿液中11-脱氢血栓烷b2的液相色谱-串联质谱方法的准确度和精密度
[0062]
基于试剂盒的检测方法的准确度和精密度评价实施方案如下：
[0063]
采用添加低、中、高3个浓度的混合血浆样本作为待测样本，对3个浓度样本每批次各6份进行检测，测定3个批次，测定实施过程同实施例2，分别计算准确度、批内cv和批间cv，结果显示如下表，显示该方法具有优异的准确度和精密度性能。
[0064]
表2方法的准确度和精密度性能
[0065][0066]
实施例4尿液中加入稳定剂前后稳定性对比
[0067]
1、分别选取6个不同人尿液进行不加稳定剂样本室温24小时和6小时稳定性考察，基于试剂盒的检测方法测定结果见表3。
[0068]
表3不加稳定剂人尿液样本室温稳定性结果
[0069][0070]
结果显示：尿液在采尿管中室温放置24小时后检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差re％均超出
±
15％，即室温放置24小时人尿液样本不稳定。尿液在采尿管中室温放置6小时后检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差re％＜
±
15％，即室温放置6小时人尿液样本稳定。
[0071]
2、选取6个不同人尿液进行加入稳定剂样本室温稳定性考察，基于试剂盒的检测方法测定结果见表4。
[0072]
表4加入稳定剂后人尿液样本室温稳定性结果
[0073][0074]
结果显示：在采尿管中加入稳定剂后室温放置7天检测，与尿液样本立即处理后即刻检测的浓度相对偏差re％＜
±
15％，即加入稳定剂后室温放置7天尿液样本稳定。
[0075]
实施例5参考区间
[0076]
在确定本试剂盒的参考区间时，从医院或健康体检中心收集健康人(或正常人)尿液样本1530例，按下表分组，其中男性和女性各765例。计算正常人样本检测值的单侧95％(上限)作为参考值。
[0077][0078]
经计算所得本试剂盒参考区间结果如下：
[0079][0080]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。