7-羟基香豆素的检测方法及试剂盒与流程

本申请属于检测，尤其涉及一种7-羟基香豆素的检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、香豆素的主要活性代谢产物为7-羟基香豆素，它们均为脂溶性，在肠道内能被迅速吸收。但是7-羟基香豆素很易被葡糖醛化，因此，在大多数物种中，香豆素在首过效应中迅速而广泛地被代谢。因此香豆素的在某一物种内的生物利用度取决于7-羟基香豆素在该物种体内的活化途径。比如在人体或其它灵长类动物的肝脏中，这种代谢途径很活跃，因此很少有未代谢的香豆素进入体循环中，甚至是没有。基于此，在香豆素的治疗中，7-羟基香豆素被认为是主要的发挥活性作用的物质。

2、当前主要以单一检测7-羟基香豆素为主，检测技术涉及hplc，lc-ms/ms。同时检测2种物质则多应用于法医或毒理学家研究，极少用于药代动力学研究。这是因为目前的方法同时检测2种物质的检测灵敏度远远不够，尤其是定量下限的灵敏度，一般在0.25～100ng/ml，如ursula geister同步检测7-羟基香豆素和去甲7-羟基香豆素，各自的定量范围10～20ng/ml，3-10ng/ml。此外，这些分析方法在检测7-羟基香豆素的同时，还检测另外的抗抑郁和抗精神病药物，若分子量接近或有旋光异构体的话，可能存在相互干扰的不足。

3、目前，微量7-羟基香豆素及其代谢物的萃取方法主要包括液液萃取或固相萃取。其中，采用lc-ms/ms的方法对7-羟基香豆素进行液液萃取，该模式的最大问题在于样本处理量需求比较大，势必不适用与脑脊液、全血、以及药代动力学检测中的样本(收集体积常常满足不了液液萃取的用量)；而采用固相萃取的方法提取7-羟基香豆素的方法中，由于采用的萃取柱含有混合型阳离子交换反相吸附剂，对碱性化合物具有较高选择性和灵敏度，导致萃取得到的产物杂质含量较高，以至于影响了目的产物7-羟基香豆素的具体含量，对于较低的含量，目前普通的固相萃取处理和检测方法，不能满足人体临床研究药代动力学定量要求。因此，目前的固相萃取方式存在一定的技术缺陷，包括萃取柱的选择、萃取缓冲液、萃取过程的优化等条件摸索不到位，并且，由于萃取方法不成熟，进一步影响了对极低浓度(pg·ml-1级别)的7-羟基香豆素定量检测，以至于无法在临床研究中实现对血浆中极低浓度(pg·ml-1级别)7-羟基香豆素定量分析的需求。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种7-羟基香豆素的检测方法及试剂盒，旨在解决现有技术中对极低浓度(pg·ml-1级别)7-羟基香豆素无法进行单一物质的萃取及实现定量检测分析的问题。

2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本申请提供一种7-羟基香豆素的检测方法，包括如下步骤：

4、提供黄光试验条件；

5、配制不同浓度的7-羟基香豆素标准品的标准溶液，将不同浓度的7-羟基香豆素标准品的标准溶液和空白血浆混合，配制不同浓度的标准曲线血浆样品，进行lc-ms/ms色谱检测得到标准图谱，进行线性回归，得到血浆中7-羟基香豆素的线性回归方程及相关系数，

6、提供样品，将样品进行固相萃取得到待测样品；

7、将待测样品在与标准曲线血浆样品相同的检测条件下进行lc-ms/ms色谱检测，获得样品的质谱分析结果，确定待测样品中7-羟基香豆素的含量。

8、第二方面，本申请提供一种基于7-羟基香豆素的检测方法的7-羟基香豆素的试剂盒，试剂盒包括：7-羟基香豆素标准品、7-羟基香豆素质控工作液、7-羟基香豆素-d5内标品、96位固相萃取小柱及萃取溶剂。

9、本申请第一方面提供7-羟基香豆素的检测方法，该检测方法中，一方面，开发了一个新的固相萃取的处理过程，只需要少量待测样品，即可萃取得到含有浓度低至10.000pg·ml-1的待测样本，整个萃取过程处理时间短，不需要采用复杂有机溶液，不会造成产物污染，同时可以实现较高效率的待测物及其代谢产物的回收，满足低于10pg·ml-1级别的血药浓度含量测定，进一步显著提高了该方法的灵敏度；另一方面，本申请采用的是lc-ms/ms色谱检测技术，通过优化lc-ms/ms色谱检测的各参数，进而达到检测快速、高效、灵敏度高，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，使血浆中极低浓度(pg·ml-1级别)的7-羟基香豆素可以达到较好的定性定量分析，可实现快速、准确的大通量检测。

10、本申请第二方面提供的基于7-羟基香豆素的检测方法的7-羟基香豆素的试剂盒，该试剂盒可实现7-羟基香豆素浓度低至10.000pg·ml-1的血浆样本的定量检测，极高的灵敏度满足相关临床研究对分析检测极低浓度7-羟基香豆素的需求，本试剂盒标准曲线和质控标准血浆样品中血浆的占比保持在95％，可基本模拟临床样本的真实情况，避免由于工作溶液的加入导致自配血浆样品与临床样本存在差距，并且试剂盒中提前制备好待测物和内标工作液，使用时只需将工作液按一定比例加入到空白血浆中即可完成待测血浆样品的制备，操作简单，可降低由于不同人员操作导致的偏差，有利于广泛使用。

技术特征：

1.一种7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，将所述样品进行固相萃取得到待测样品的步骤中，包括：

3.根据权利要求2所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，将样品进行预处理得到预处理后样品的步骤中，包括：将所述样品与内标工作液、磷酸水溶液进行混合处理，得到预处理后样品；和/或，

4.根据权利要求3所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱选自96位固相萃取板，填料为cleanert pep，填料规格为2mg/孔；和/或，

5.根据权利要求1所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms色谱检测中，所述液相色谱的检测条件如下：

6.根据权利要求5所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

7.根据权利要求1所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms色谱检测中，所述质谱的检测条件如下：

8.根据权利要求1所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述不同浓度的7-羟基香豆素标准品的标准溶液包括浓度为0.200～10.000ng·ml-1的7-羟基香豆素标准品的标准溶液；和/或，

9.根据权利要求8所述的7-羟基香豆素的检测方法，其特征在于，所述不同浓度的7-羟基香豆素标准品的标准溶液的制备方法包括：提供7-羟基香豆素对照品储备液，采用质量百分浓度为50％～55％的甲醇水溶液稀释，得到不同浓度的7-羟基香豆素标准品的标准溶液；和/或，

10.一种基于权利要求1～9任一所述的7-羟基香豆素的检测方法的7-羟基香豆素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：7-羟基香豆素标准品、7-羟基香豆素质控工作液、7-羟基香豆素-d5内标品、96位固相萃取小柱及萃取溶剂。

技术总结
本申请涉及检测技术领域，尤其涉及一种7‑羟基香豆素的检测方法及试剂盒，提供了一种7‑羟基香豆素的检测方法，包括如下步骤：提供黄光试验条件；配制不同浓度的7‑羟基香豆素标准品的标准溶液，将不同浓度的7‑羟基香豆素标准品的标准溶液和空白血浆混合，配制不同浓度的标准曲线血浆样品，进行LC‑MS/MS色谱检测得到标准图谱，进行线性回归，得到血浆中7‑羟基香豆素的线性回归方程及相关系数，提供样品，将样品进行固相萃取得到待测样品；将待测样品在与标准曲线血浆样品相同的检测条件下进行LC‑MS/MS色谱检测，获得样品的质谱分析结果，确定待测样品中7‑羟基香豆素的含量。

技术研发人员：欧阳忠华,唐智,董峻
受保护的技术使用者：长沙都正生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12