一种用于诊断儿童青少年抑郁症的尿液生物标志物组合以及应用

1.本发明涉及神经精神疾病诊断标志物以及诊断方法技术领域，具体涉及一种用于诊断儿童青少年抑郁症的尿液生物标志物组合以及应用。


背景技术：

2.抑郁症(major depressive disorder)是一种以显著而持续的情绪低落、思维迟缓和意志活动下降为主要症状的情感障碍。流行病学调查表明，抑郁症在儿童期(13岁以下)的患病率为4.3％，而青少年(13-18岁)为5.0％。2014年who报告指出，抑郁症是导致青少年疾病和残疾的首要原因，超过一半的自杀受害者在死亡时符合抑郁症的诊断标准，增加了这个年龄段的疾病负担。此外，儿童青少年抑郁症可能会与焦虑障碍、睡眠障碍、注意缺陷与多动障碍等共病，导致容易漏诊和误诊。
3.生物标志物(biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。尿液就是一个很好的生物标志物的载体，不仅因为其是非侵入性收集的，还因为量大、预处理少、收集方便。基于成人尿液的研究发现成人抑郁症患者代谢物的改变主要集中在葡萄糖代谢、犬尿氨酸代谢和酪氨酸-苯丙氨酸代谢等，进而发现了关于成人抑郁症的各种标志物。申请人在文献中报道了(a novel urinary metabolite signature for diagnosing major depressive disorder，j proteome res.2013dec 6；12(12):5904-11.doi:10.1021/pr400939q.epub2013nov 26.)：通过gc-ms研究，在成人尿液中发现了山梨醇(sorbitol)、尿酸(uric acid)、壬二酸(azelaic acid)、喹啉酸(quinolinic acid)、马尿酸(hippuric acid)和酪氨酸(tyrosine)可以作为诊断成年人抑郁症的生物标志物。然而，现有技术有报道称儿童青少年抑郁症与成人抑郁症的代谢途径并不完全相同。根据这些研究结果推测，儿童青少年抑郁症的尿液代谢特征可能与成人不同，涉及的反映儿童青少年抑郁症的生物标志物也应与成人抑郁症的各种标志物存在差异，现有技术中尚未见能够准确反应儿童青少年抑郁症的以尿液为载体的生物标记物。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种用于诊断儿童青少年抑郁症的尿液生物标志物组合，以解决现有技术中缺少针对儿童青少年抑郁症的容易取样和处理的生物标志物的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种生物标志物组合，其由肉碱类化合物、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸组成；所述肉碱类化合物的smiles分子结构为[o-]c(cc(oc(/c＝c/ccccccccccc(o)＝o)＝o)c[n+](c)(c)c)＝o。
[0007]
本发明还提供了一种生物标志物组合在制备诊断系统中的应用，所述诊断系统用
于检测尿液中肉碱类化合物、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸的含量；所述肉碱类化合物的smiles分子结构为[o-]c(cc(oc(/c＝c/ccccccccccc(o)＝o)＝o)c[n+](c)(c)c)＝o。
[0008]
本方案的原理及优点是：
[0009]
发明人通过对儿童青少年抑郁症患者以及正常儿童青少年的大量代谢组学研究以及比较研究，发现了尿液中肉碱类化合物、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸的含量可以客观反应抑郁症患病与否的情况。并且，同时使用上述七种代谢物进行诊断和评价，可以更为准确地反应出抑郁症情况。基于这七种代谢物的相对含量情况，发明人利用二元逻辑回归(binary logistic regression analysis)建立诊断模型，再对诊断模型的诊断效力进行了接受者操作特性曲线分析(roc)，由上述七个自变量建立的诊断模型就有良好的诊断效果，曲线下面积auc值可达到近0.8。因此，上述七种代谢物可以作为诊断儿童青少年抑郁症的生物标志物，联合其他临床指标进行诊断。在后续应用中，我们可以将本技术方案的研究成果(七种生物标志物)在更多生物样本中进行研究。经过对更多人群的七种生物标志物的检测，拟合获得可以更为准确反映疾病情况的诊断模型，进而获得诊断参考值应用于实际临床诊断的实践中。
[0010]
目前，针对成人抑郁症的研究较多，现有技术中尚缺乏针对儿童青少年抑郁症的诊断方法。而成人抑郁症和儿童青少年抑郁症的发病机制、治疗手段均存在差异，成人抑郁症的研究成果对儿童青少年抑郁症的指导性不强。本技术方案首次将儿童青少年抑郁症中的患抑郁症未用药、患抑郁症用药和健康对照分组研究，筛选出患抑郁症未用药和患抑郁症用药的共同差异代谢物，获得了可以准确反映儿童青少年抑郁症的生物标志物。不同于现有技术的将患抑郁症未用药和患抑郁症用药合并的研究结果。
[0011]
另外，本发明中用于诊断儿童青少年抑郁症的七种生物标志物在临床应用中样本均来源于尿液，取材简单且无创，具有一定临床应用价值。
[0012]
进一步，一种生物标志物组合，其用于诊断儿童青少年抑郁症。本技术方案的生物标志物可用于儿童青少年抑郁症的诊断。儿童青少年抑郁症与成人抑郁症的代谢途径并不完全相同，儿童青少年抑郁症的尿液代谢特征与成人不同，涉及的反映儿童青少年抑郁症的生物标志物也应与成人抑郁症的各种标志物存在差异，现有技术中尚未见能够准确反应儿童青少年抑郁症的以尿液为载体的生物标记物。
[0013]
进一步，一种生物标志物组合，其提取自生物体尿液。尿液就是一个很好的代谢物生物标志物的载体，其可以进行非侵入性收集、量大、预处理少。
[0014]
进一步，所述诊断系统包括预处理单元和检测单元，所述检测单元包括液相色谱设备和质谱设备。
[0015]
通过常规的气相色谱、液相色谱、液相色谱-质谱/质谱等手段，均可实现对上述七种差异代谢物的检测。本技术方案选用了液相色谱设备和质谱设备进行检测，不但可以实现对标志物的筛选和可以实现对这些物质相对含量的表征，最终达到评价或者诊断疾病的目的。
[0016]
进一步，所述液相色谱设备使用的色谱柱包括酰胺柱和c18柱；使用酰胺柱时，流动相a为含有25mm氢氧化铵和25mm乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈；使用c18柱时，流动相a为含有0.01％乙酸的水溶液，b为体积比为1：1的异丙醇和乙腈的混合溶液。
[0017]
进一步，所述液相色谱设备的参数设置为：柱温为25℃，样品注射量为4μl，流速为0.5ml/min；
[0018]
对于酰胺柱，梯度设定如下：0-0.5分钟为95％流动相b；0.5-7分钟为95％流动相b到65％流动相b；7-8分钟为65％流动相b到40％流动相b；8-9分钟为40％流动b；9-9.1分钟为40％流动相b到95％流动相b；以及9.1-12分钟为95％流动相b；
[0019]
对于c18柱，梯度设置如下：0-1分钟为1％流动相b；1-8分钟为1％流动相b到99％流动相b；8-9分钟为99％流动相b；9-9.1分钟为99％流动b到1％流动相b；9.1-12分钟为1％流动相b。
[0020]
进一步，质谱设备的参数设置为：喷雾电压，正负模式分别为3500v或-2800v；离子转移管温度350℃；鞘气50arb；辅助气体15arb；蒸发器温度400℃。
[0021]
进一步，数据采集在full ms扫描模式和dd-ms2扫描模式下进行；full ms扫描模式的分辨率设置为60000；正负模式的agc目标设置为1e6；最大it设置为100ms；质量范围设置为70-1200da；对于dd-ms2扫描模式，分辨率设置为30000，正负模式的agc目标设置为1e5；最大it设置为60ms；top n设置为6；隔离宽度设置为1.0；碰撞能量设置为snce 20-30-40％；动态排除设置为3.0秒，同位素排除打开。
[0022]
进一步，所述预处理单元包括离心设备、超声设备、冷冻设备、真空浓缩设备、甲醇和乙腈的水溶液。
[0023]
在上机测量之前，将尿液样本离心处理，得到的上清液，再使用甲醇与样本混合，进一步冷冻处理，通过沉淀操作除去尿液中的蛋白质。所得的上清液在真空浓缩器中蒸发至干，再使用乙腈的水溶液将干燥的提取物复溶，再进行lc-ms/ms分析。上述操作可以充分出去杂质，并保证后续液相以及质谱分析的顺利进行。
附图说明
[0024]
图1为实施例1的an-mdd和hc受试者opls-da分析结果。
[0025]
图2为实施例1的at-mdd和hc受试者opls-da分析结果。
[0026]
图3为实施例1的七种共同差异代谢物的相对含量统计结果。
[0027]
图4为实施例1的an-mdd组的metaboanalyst代谢通路分析结果图。
[0028]
图5为实施例1的at-mdd组的metaboanalyst代谢通路分析结果图。
[0029]
图6为实施例1的训练集样本的roc曲线。
[0030]
图7为实施例1的测试集样本的roc曲线。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
[0032]
实施例1：
[0033]
(1)实验对象
[0034]
本实验共招募192名受试者，年龄范围10-18岁，其中，患抑郁症未用药(an-mdd)80人，患抑郁症用药(at-mdd)37人，健康对照(hc)75人。三组之间年龄、性别、bmi无统计学差
异。受试者的详细信息请见表1。
[0035]
表1：受试者信息
[0036][0037]
上表中的缩写和上标的具体释义如下：
[0038]
hc,health controls，健康对照；
[0039]
an-mdd, major depressive disorder，患抑郁症未用药；
[0040]
at-mdd,antidepressant-treated major depressive disorder，患抑郁症用药；
[0041]
bmi,body mass index，身体质量指数；
[0042]
hamd-17,17-item hamilton depression rating scale，汉密尔顿抑郁量表17项；
[0043]
hama,hamilton anxiety rating scale，汉密尔顿焦虑量表；
[0044]
na,not applicable，不适用；
[0045]
p-value＜0.05versus hc；
[0046]
p-value＜0.05versus an-mdd；
[0047]
a chi-square test；
[0048]
b kruskal-wallis h test；
[0049]
c mann-whitney u test。
[0050]
(2)样本的收集以及前处理
[0051]
在无菌管中收集受试者中段晨尿。然后，将尿液样本离心10分钟(3,000rpm，室温)。得到的上清液被分装并储存在-80℃。招募结束后，将50μl样品与150μl甲醇混合，然后涡旋30秒。为了沉淀蛋白质，将样品在-20℃下沉淀1小时，然后离心15分钟(13000rpm，4℃)。所得的上清液在真空浓缩器中蒸发至干。将干燥的提取物重新溶解在100μl的重组溶液中(乙腈：水＝1：1，v/v)，超声处理10分钟，离心15分钟(13000rpm，4℃)。将上清液转移到hplc小瓶中，在进行lc-ms/ms分析前储存在-80℃。样品(50μl)用150μl甲醇和内参(d3-亮氨酸和d8-苯丙氨酸)进行提取。
[0052]
(3)超高效液相色谱-质谱联用检测参数设置
[0053]
数据采集在超高效液相色谱系统(vanquish uhplc,thermofisher scientific,
united states)上进行，并与质谱仪(orbitrap exploris 480,thermofisher scientific,united states)联用。
[0054]
采用waters acquity uplc beh amide柱(1.7μm粒径，100mm
×
2.1mm)进行分离，柱温为25℃，样品注射量为4μl。对于酰胺柱，流动相a为含有25mm氢氧化铵和25mm乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈，流速为0.5ml/min，梯度设定如下：0-0.5分钟为95％(体积百分数)流动相b；0.5-7分钟为95％流动相b到65％流动相b；7-8分钟为65％流动相b到40％流动相b；8-9分钟为40％流动b；9-9.1分钟为40％流动相b到95％流动相b；以及9.1-12分钟为95％流动相b。并采用phenomenex kinetex c18柱(2.6μm粒径，100mm
×
2.1mm)进行分离，柱温为25℃，样品注射量为4μl。对于c18柱，流动相a为含有0.01％乙酸的水溶液，b为异丙醇和乙腈(v:v＝1:1)，流速为0.5ml/min，梯度设置如下：0-1分钟为1％流动相b；1-8分钟为1％流动相b到99％流动相b；8-9分钟为99％流动相b；9-9.1分钟为99％流动b到1％流动相b；9.1-12分钟为1％流动相b。在数据采集期间，所有的样品都是随机注入的。
[0055]
电源参数设置如下：喷雾电压，正负模式分别为3500v或-2800v；离子转移管温度，350℃；鞘气，50arb；辅助气体，15arb；蒸发器温度，400℃。数据采集在full ms扫描模式和dd-ms2扫描模式下进行，full ms扫描模式的分辨率设置为60000；正负模式的agc目标设置为1e6；最大it设置为100ms；质量范围设置为70-1200da。对于dd-ms2扫描模式，分辨率设置为30000，正负模式的agc目标设置为1e5；最大it设置为60ms。top n设置为6。隔离宽度设置为1.0。碰撞能量设置为snce 20-30-40％。动态排除设置为3.0秒，同位素排除打开。
[0056]
(4)数据分析
[0057]
将上一步骤获得的原始质谱数据(.raw)由proteowizard(version 3.06150)转换为mzxml格式。r软件包“xcms”(version 3.12)用于峰值检测、保留时间校正和峰值校准。xcms处理参数设置如下：峰值检测的质量精度＝10ppm；峰值宽度c＝(5，30)；snthresh＝3；mzwid＝0.015；minfrac＝0.5。峰表上传到metflow(http://metflow.zhulab.cn/)进行归一化，以消除批次内和批次间出现的不必要的系统误差。使用metdna进行代谢物注释。简而言之，我们通过匹配准确的质量、保留时间和ms/ms相似性，使用内部代谢物光谱库进行代谢物注释。根据msi，匹配的代谢物被视为1级鉴定。通过匹配精确质量和ms/ms相似性，实现msi水平2置信度的代谢物鉴定。使用外部公共代谢物库和脂质谱库。metdna注释的其他代谢物鉴定被认为是msi3级。使用点积算法计算ms/ms光谱相似性，并将截止值设置为0.8。使用京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes)id计算独特代谢物的数量。之后，进行正交偏最小二乘法判别分析(opls-da)，在对数转换后可视化可比组之间的判别。为了排除组间分离的非随机性，进行了200次的置换检验。通过对opls-da负荷的分析，确定了负责两组之间区分的差异代谢物(预测中的变量重要性(vip)＞1和p值＜0.05)。metaboanalyst(www.metaboanalyst.ca)和ingenuity pathway analysis(ipa,http://www.ingenuity.com)被用来进一步探索差异代谢物的生物学功能。an-mdd和at-mdd之间共同的差异代谢物被确定为潜在的诊断生物标志物。进行接收操作特征(roc)分析以量化代谢物生物标志物小组区分mdd和hc的能力。上述数据处理过程为代谢组学研究常规数据处理方法。
[0058]
(5)结果分析
[0059]
(5.1)an-mdd组和hc组之间的代谢情况比较
[0060]
通过非靶代谢组学分析，在阳性和阴性模式(esi+/-)下分别鉴定了695和846个代谢物。opls-da模型的得分图显示an-mdd和hc受试者之间有明显的区别(图1a)。此外，置换检验显示，所建立的opls-da模型是有效的，并且没有过度拟合(图1b)。接下来，根据标准(p值＜0.05和vip值＞1)，我们筛选了140个代谢物，差异代谢物举例参见表2。表3中统计了an-mdd组和hc组之间的差异代谢物出现特征峰的保留时间和特征峰面积，进而判断患病和正常人之间，尿液中的物质含量变化情况。在表2中，峰面积比值是指an-mdd组的特定物质的特征峰面积的平均值除以hc组的特定物质的特征峰面积的平均值，反映的是尿液中某个特定物质的物质含量变化情况。表2中的p值为对an-mdd组的特定物质的特征峰面积和hc组的特定物质的特征峰面积进行的u检验，p＜0.05表示有显著差异；vip＞1，即认为差异代谢物有意义，数值可信。vip(variable important in projection)是opls-da模型变量的变量权重值，可用于衡量各代谢物积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，vip≥1为常见的差异代谢物筛选标准。
[0061]
表2：an-mdd组和hc组之间的差异代谢物举例
[0062][0063]
[0064]
(5.2)at-mdd组和hc组之间的代谢情况比较
[0065]
分析过程与上述分析保持一致。opls-da模型的得分图显示at-mdd和hc受试者之间有明显的分离(图2a)。此外，置换检验的结果显示，opls-da模型也是有效的(图2b)。然后，根据标准(p值＜0.05和vip值＞1)，我们筛选了68个差异性代谢物，代表性差异代谢物详见表3。
[0066]
表3：at-mdd组和hc组之间的差异代谢物举例
[0067][0068]
(5.3)筛选能识别儿童青少年抑郁的生物标志物
[0069]
为了研究与儿童青少年mdd诊断有关的尿液生物标志物，而不是疾病严重程度，并避免抗抑郁治疗的可能影响，进一步评估了an-mdd和at-mdd之间共同的差异代谢物。在an-mdd组的140个差异性代谢物和at-mdd组的68个差异性代谢物中，有7个基于metdna标准的置信度为1的共同差异代谢物(图3，表4，表5)，图3展示了每组内样本峰面积的2为底对数值(log2(样本中目标代谢物的峰面积)，纵坐标),an-mdd和at-mdd组之间这七种代谢物的水平没有显著差异。
[0070]
在an-mdd组中使用metaboanalyst进行的代谢通路分析确定了六条改变的通路：烟酸和烟酰胺代谢，组氨酸代谢，牛磺酸和亚牛磺酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢以及精氨酸生物合成(图4)，ipa确定的分子相互作用网络是“发育障碍、遗传性障碍、代谢性疾病”以及“自由基清除、氨基酸代谢、细胞间信号传导和相互作用”的网络显著改变。在at-mdd组中使用metaboanalyst进行的代谢通路分析确定了两条改变的通路：乙醛酸和二羧酸代谢以及脂肪酸生物合成(图5)，ipa确定的分子相互作用网络是“分子运输、细胞信号、维生素和矿物质代谢”。从功能分析结果来看，由于抗抑郁的药物的服用，使得患者的代谢通路发生了显著变化，所以an-mdd和at-mdd两组的相对于正常人发生变化的代谢通路的差异很大。按照本领域技术人员的常规分析逻辑，人体新陈代谢对于药物非常敏感，服药会导致代谢通路发生非常大的改变。图4和图5的分析结果也充分说明了上述观点。如果我们以代谢物为标志物进行青少年儿童抑郁症的诊断，基于上述认知，患者在首诊时(还未服药)使用的检测标志物应该与服药后使用的检测标志物不同，才能保证诊断的准确性。发明人在对an-mdd组(相对于正常组)和at-mdd组(相对于正常组)进行代谢组学分析之后，将两者的差异代谢物进行比对，意外地发现了共同差异代谢物的存在，说明在服药之后，虽然整体代谢通路发生了翻天覆地的变化，但是仍然存在7种共同的差异代谢
物，这是现有技术中没有任何报道的。为了进一步验证7种差异代谢物是否能够有效地进行青少年儿童抑郁症的诊断，发明人进而将7种共同代谢物应用到训练集和测试集中进行诊断效果测试，发现7种共同代谢物的联合诊断效果非常理想，可以有效地区分青少年抑郁症患者以及正常人。所以，由于服药原因，两组(an-mdd组和at-mdd组)相对于正常人，两组之间的差异代谢通路截然不同，但是两组之间却存在共同差异代谢物，并且共同差异物的整体vip值较为理想，7种共同代谢物的联合使用可以实现对青少年抑郁症诊断，上述发现突破了我们对本领域的常规认知。
[0071]
另外，在本研究中，我们选取的样本中，an-mdd组和at-mdd组的hamd-17值相近，说明服药虽然改变了整体的代谢通路，但是并没有使得抑郁症得到有效缓解。本研究发现了与抑郁症症状具有本质联系的7种共同代谢物。7种共同代谢物与服药与否并未形成显著关联，但是他们可以直接反应抑郁症的治愈情况。标志物的对抑郁症的诊断准确程度不受服药与否的影响，如果服药能促进抑郁症症状缓解，则可以从标志物的检测上反映出来。上述标志物的发现具有较大的实际意义。往往我们是在首诊(患者未服药)的时候确认是否患有儿童青少年抑郁症，并制定治疗方案，然后再通过随访或者定期检查，确定患者的恢复情况。首诊和随访通常需要采用不同的标志物或者手段。但是，采用本技术方案的7种共同代谢物，由于他们与抑郁症情况之间具有较为本质的关联，我们可以将其联合应用于儿童青少年抑郁症的首诊，以及采取治疗手段之后的随访。
[0072]
表4：7个共同差异代谢物的基本情况
[0073][0074]
表5：生物标志物功能描述
[0075][0076][0077]
完成上述标志物筛选之后，我们将192位受试者按7：3分随机为训练集和测试集，其中训练集包括82名mdd患者和53名hc，测试集包括35名mdd患者和22名hc。基于这七种生物标志物，利用二元逻辑回归建立诊断模型(诊断变量(自变量)为七种生物标志物的特征峰面积，应变量为患有mdd和未患病者hc，即是否患有mdd的二元变量)，再进行接收操作特征(roc)分析，以量化包含七个代谢物的生物标志物组合的诊断性能。二元逻辑回归和roc分析均使用现有技术的常规统计软件spss 21.0(ibm corp.,armonk,ny,usa)进行。roc曲线用来评判分类、检测结果的好坏，是非常重要和常见的统计分析方法，是以假阳性率(falsepositiverate，1-特异性)为横轴，真阳性率(truepositiverate，敏感性)为纵轴所组成的坐标图，测试样本在不同的判断标准(阈值)得出的不同结果画出的曲线。曲线下面积auc用来表示准确性，auc值越高，说明准确率越高。训练集中roc曲线下的面积(auc)值为0.820(95％置信区间(ci)：0.750-0.891；敏感性：69.9％；特异性：88.7％，图6)，测试集中roc曲线下的面积(auc)值为0.796(95％置信区间(ci)：0.681-0.911；敏感性：68.6％；特异性：86.4％，图7)。
[0078]
对比例1
[0079]
为了进一步优化诊断效果，在确认7种共同代谢物之前，发明人尝试了使用不同生物标志物的相对含量来进行诊断效果分析，分析方法同实施例。
[0080]
测试一：选用尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸作为用于诊
断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.802，测试集0.805。
[0081]
测试二：car 14:1；o2、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.804，测试集0.787。本测试选用的标志物相比于7种共同标志物缺少尼古丁，尼古丁在表2和表3中的vip值以及排序较低，本领域技术人员倾向于将尼古丁排除到生物标志物组合之外。经测试，排除尼古丁之后，诊断模型的auc值降低，诊断效果不理想，证明将尼古丁纳入诊断标志物组合是非常必要的。
[0082]
测试三：car 14:1；o2、尼古丁、六酰甘氨酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.805，测试集0.743。本测试选用的标志物相比于7种共同标志物缺少胍基乙酸，胍基乙酸在表2中的vip值以及排序较低，本领域技术人员倾向于将胍基乙酸排除到生物标志物组合之外。经测试，排除胍基乙酸之后，诊断模型的auc值降低，诊断效果不理想，证明将胍基乙酸纳入诊断标志物组合是非常必要的。
[0083]
测试四：car 14:1；o2、尼古丁、胍基乙酸、丙烯酸、黄尿酸和十二酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.772，测试集0.756。本测试选用的标志物相比于7种共同标志物缺少六酰甘氨酸，六酰甘氨酸在表2中的vip值以及排序较低，本领域技术人员倾向于将六酰甘氨酸排除到生物标志物组合之外。经测试，排除六酰甘氨酸之后，诊断模型的auc值降低，诊断效果不理想，证明将六酰甘氨酸纳入诊断标志物组合是非常必要的。
[0084]
测试五：car 14:1；o2、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、黄尿酸和十二酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.789，测试集0.777。本测试选用的标志物相比于7种共同标志物缺少丙烯酸，丙烯酸在表3中的vip值以及排序较低，本领域技术人员倾向于将丙烯酸排除到生物标志物组合之外。经测试，排除丙烯酸之后，诊断模型的auc值降低，诊断效果不理想，证明将丙烯酸纳入诊断标志物组合是非常必要的。
[0085]
测试六：car 14:1；o2、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸和十二酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.811，测试集0.800。
[0086]
测试七：car 14:1；o2、尼古丁、胍基乙酸、六酰甘氨酸、丙烯酸和黄尿酸作为用于诊断青少年抑郁症的标志物，经二元逻辑回归和roc分析，诊断模型的auc值为：训练集0.817，测试集0.770。本测试选用的标志物相比于7种共同标志物缺少十二酸，经测试，排除丙烯酸之后，诊断模型的auc值降低，诊断效果不理想，证明将丙烯酸纳入诊断标志物组合是非常必要的。
[0087]
综上，有且只有这七个生物标志物的组合能有更优秀的诊断效能。
[0088]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，
说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。