一种基于自组装DNA核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法

一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法
技术领域
1.本发明涉及分析化学医学检测技术领域，结合核酸适配体技术，具体涉及一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法。


背景技术：

2.甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)是一种70kda的糖蛋白，含有约4％的碳水化合物，主要由妊娠期间的胎儿肝脏产生。正常情况下，甲胎蛋白血清浓度在小孩出生后急剧下降，成年后其合成受到极大抑制。然而，70％以上肝癌患者肿瘤排泄的afp血清浓度较高，故临床将afp作为肝癌及其他癌症的肿瘤标志物。因此，血清afp的早期筛查对肿瘤患者临床早期诊断及预后中起着非常重要的作用。
3.三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，atp)作为细胞代谢的主要能量分子，在调节各种生命活动中起着不可替代的作用。大量研究表明，生物体中的atp浓度与许多疾病密切相关，如低血糖、心血管疾病和一些恶性肿瘤。此外，atp可作为细胞代谢的有效指标，实时监测一些肿瘤患者病程状况。因此，敏感、可靠地检测atp是病理诊断的关键。
4.核酸适配体(aptamer，apt)技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适体是通过selex技术体外筛选出来的能够特异性结合目标物配体的寡核苷酸片段。其以特有的高亲和力及特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合配体，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而想要获得可行的检测方法，建立高效且能实现多配体同时检测的适配体传感器是关键。首先，适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量有规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
5.目前临床上多采用荧光、紫外等方法检测肿瘤标记物，存在灵敏性差、应用效果不好的问题；此外还有化学发光方法(chemiluminescence，cl)检测肿瘤标记物，但大部分只能用于单一肿瘤标记物检测，无法实现多组分同时检测，仍存在耗时长、灵敏度不够高的情况。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，适体技术巧妙结合磁性微球的“同相反应，异相分离”特点，创建了基于自组装适体及dna核酸链化学发光生物传感器，可实现两种甚至多种肿瘤标记物的同时检测。本发明实现了一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，能够快速、高效地同时实现afp和atp检测，为医学检测提供
了新的思路，且对多组分研究测定具有重大意义，更有望进一步实现全自动大批量检测。
7.一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其中涉及三磷酸腺苷适体(atp aptamer，apt1)、甲胎蛋白适体(afp aptamer，apt2)、信号dna链1(signal dna 1，s1)、桥梁dna链(bridge-dna，b)、信号dna链2(signal dna 2，s2)、与s1互补的dna链(capture-dna complementary to s1，c1)、与s2互补的dna链(capture-dna complementary to s2，c2)。其中，atp可与apt1特异性识别，afp可与apt2特异性识别，s1可与c1碱基互补配对，s2可与c2碱基互补配对，b主要用于辅助构造自组装dna核酸链，c1、c2末端的氨基可与羧基修饰的磁性微球通过酰胺键结合。过程中，还使用了由链霉亲和素(streptavidin，sa)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)交联所得的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(hrp-sa)，化学发光试剂苯甲酰甲醛(phenylglyoxal，pg)。
8.具体采用以下技术方案：
9.1)将apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
10.2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
11.3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1复合物；
12.4)将步骤2)所得产物与过量的磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
13.5)将步骤4)所得固相与sa-hrp混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
14.6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
15.7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
16.8)将步骤4)反应的剩余溶液与过量的磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
17.9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
18.作为优选，步骤1)包括以下步骤：分别取6μl、100μm的aptl、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
19.作为优选，步骤2)包括以下步骤：取10μl、10-8
μm afp和10μl、10-8
μmatp于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
20.作为优选，步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min。
21.作为优选，步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
22.作为优选，步骤3)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。
23.作为优选，步骤4)包括以下步骤：取步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
24.作为优选，步骤5)包括以下步骤：取浓度1∶8000～1∶6000、100μlsa-hrp与步骤4)所得固相混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
25.作为优选，步骤6)包括以下步骤：取步骤5)所得产物与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，检测化学发光cl值。
26.作为优选，步骤7)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。
27.作为优选，步骤7)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
28.作为优选，步骤7)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。
29.作为优选，步骤8)包括以下步骤：取步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
30.作为优选，步骤9)包括以下步骤：取步骤8)所得产物与10μl四丁基溶液混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，检测化学发光cl值。
31.作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
32.作为优选，所述检测化学发光信号cl值，是利用微弱化学发光仪bpcl实现的。
33.在以上技术方案中，所述ba缓冲液、咪唑缓冲液、pbst缓冲液可依据本领域的一般技术常识选择常规的配方实施本发明。
34.在以上技术方案中，所述apt1的报告序列如下：5
’‑
agagaacctgggggagtattgcggaggaaggt-3’。所述apt2的报告序列如下：5
’‑
gtgacgctcctaacgctgactcaggtgcagttctcgactcggtcttgatgtgggtcctgtccgtccgaaccaatc-3’。所述s1的报告序列如下：5
’‑
biotin-gattggttcggacgg-3’。所述b的报告序列如下：5
’‑
acccacatcaagaccgagtcgagaactgcacctgagtcagcgttcggagcgtcacaaaaaaccttcctccgc-3’。所述s2的报告序列如下：5
’‑
tcccccaggttctctgggggggggg-3’。所述所述c1的报告序列如下：5
’‑
nh
3-ccgtccga accaatc-3’。c2的报告序列如下：5
’‑
agagaacctggggga-nh
3-3’。上述报告序列均可自试剂销售公司定制、购得。
35.所述步骤1)所得产物是指apt1、apt2、s1、b、s2分别通过碱基互补配对形成的一条自组装dna核酸链。
36.所述步骤2)充分反应是指aptl与atp特异性结合，apt2与afp特异性结合，s1、b、s2分散在溶液中。
37.所述步骤4)所得固相是指s1与磁性微球-c1复合物的c1碱基互补配对形成的固相。
38.所述步骤4)反应的剩余溶液中，含有物质apt1与atp碱基互补配对形成的双链，apt2与afp碱基互补配对形成的双链，分散的s2、b。
39.所述步骤8)中的检测atp的化学发光生物传感器是s2与磁性微球-c2复合物中的c2碱基互补配对形成的。
40.所述过量的磁性微球-c1复合物与磁性微球-c2复合物是指固定于磁性微球上的c1、c2分别与s1、s2特异性结合时，磁性微球-c1复合物或磁性微球-c2复合物用量过多，因此结合反应完成后仍存在未结合有s1的磁性微球-c1复合物或未结合有s2的磁性微球-c2复合物游离于体系中的情形；具体的磁性微球-c1复合物或磁性微球-c2复合物用量可根据对待测样品中s1或s2含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中磁性微球-c1复合物或磁性微球-c2复合物用量来实施本发明。
41.在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组具有浓度梯度且已知浓度的afp、atp标准溶液进行检测，以绘制出afp、atp浓度与发光信号cl值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。
42.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
43.本发明提供一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，其中利用寡核酸链和适体构建自组装dna核酸链，在靶目标甲胎蛋白(afp)和三磷酸腺苷(atp)的存在下，可以使自组装dna核酸链瓦解成单链结构。释放出来的单链核酸链与互补的dna链结合通过磁性分离，利用化学发光法各自检测目标物。本发明的化学发光检测机制有两种：一种是c1上结合的sa-hrp和鲁米诺-h2o2试剂产生化学发光反应，另一种是c2上的鸟嘌呤碱基(guanine，g)和pg试剂瞬时衍生化反应产生化学发光信号。该自组装dna核酸链可以在同一个初始体系中检测两种目标物，为实际应用减少了检测时间、降低了检测成本，并且该自组装dna核酸链可以替换成其他目标物的适体链或检测两个或两个以上的目标物，具有广阔的应用前景。该方法检测afp和atp的最低测限分别是1.8pg/ml和0.5nm，且通过选择性考察具有较高的特异性。
附图说明
44.图1是本发明检测方法的原理示意图。
45.图2是本发明实施例1中的afp及atp标准曲线图。
46.图3是本发明实施例1中对afp及atp检测方法的特异性考察实验结果。
具体实施方式
47.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
48.以下是实施例中的所使用的近似语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的准确范围内变化，比如“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
49.除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
50.以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
51.实施例1
52.1实验原理
53.本发明检测方法的原理示意图如图1所示。本发明首先构建了一条由apt1、apt2、s1、b、s2碱基互补配对而成的自组装dna核酸链，而后加入atp及afp特异性识别自组装dna核酸链中的apt1、apt2，使自组装dna核酸链瓦解。通过c1、c2为固定相，固定于磁性微球表面，形成磁性微球-c1复合物及磁性微球-c2复合物。然后利用磁性微球-c1复合物特异性识别自组装dna核酸链瓦解液中带有生物素的s1，取磁性微球固相，再加入sa-hrp，使其与生物素结合，构建检测afp的化学发光生物传感器。同样地，利用磁性微球-c2复合物特异性识别剩余的自组装dna核酸链瓦解液中的s2，构建检测atp的化学发光生物传感器。最后利用sa-hrp与鲁米诺产生化学发光及s2上的g碱基与pg试剂产生化学发光测定cl信号。
54.2实验方法
55.2.1自组装dna核酸链的制备
56.分别取等量6μl、100μm的apt1、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
57.2.2自组装dna核酸链的瓦解
58.取10μl、10-8
μmafp和10μl、10-8
μmatp于自组装dna核酸链中，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
59.2.3检测afp的化学发光生物传感器的制备
60.取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min，再取固相用pbst缓冲溶液洗涤。洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。取自组装dna核酸链的瓦解液加入磁性微球-c1复合物。于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。取浓度1∶8000～1∶6000、100μl sa-hrp与其混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
61.2.4化学发光检测afp
62.取检测afp的化学发光生物传感器与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。化学发光信号由bpcl微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
63.2.5检测afp的化学发光生物传感器的性能评价
64.我们首先通过对人血清样品中的afp进行加标回收实验，以评价该方法的准确性及精密度。在人血清样品中分别加入不同浓度的afp(0.1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)。在优化条件下，实验步骤同上述，每组实验平行进行三次实验，计算加标样品回收率。其次，为了检
验该实验方法的特异选择性，我们选择了与afp类似的几种物质(cea、igg、psa和bsa)进行化学发光检测。其中afp、cea、igg、psa和bsa的浓度均为10μm，其他条件保持不变，探究不同的物质对化学发光信号强度的影响。
65.2.6检测atp的化学发光生物传感器的制备
66.取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。取2.3步骤反应后剩余的自组装dna核酸链瓦解液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
67.2.7化学发光检测atp
68.取10μl四丁基溶液与检测atp的化学发光生物传感器混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，立即放入化学发光检测器中测定。化学发光信号由bpcl微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
69.2.8检测atp的化学发光生物传感器的性能评价
70.我们首先通过对人血清样本中atp进行加标回收实验，以评价该方法的准确性及精密度。在人血清样品中分别加入不同浓度的atp(5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)。在优化条件下，实验步骤同上述，每组实验平行进行三次实验，计算加标样品回收率。其次，为了检验该实验方法的特异选择性，我们选择了与atp类似的几种物质(utp、ctp和gtp)进行化学发光检测。其中atp、utp、ctp和gtp的浓度均为10μm，其他条件保持不变，探究不同的物质对化学发光信号强度的影响。
71.3实验结果
72.3.1 afp标准曲线的建立
73.在优化实验条件下(4μl磁珠、1.5μl c1、稀释系数1∶7000sa-hrp)，利用该传感器对一系列不同浓度的afp进行化学发光检测，建立化学发光标准曲线如图2中的a所示。结果显示，afp浓度在0.01ng
·
ml-1
～10ng
·
ml-1
范围内，δcl信号值与afp浓度的对数值呈现非常好的线性关系，最低检测限为1.8pg
·
ml-1
(s/n＝3)。
74.3.2检测afp的化学发光生物传感器的性能评价
75.在优化实验条件下(4μl磁珠、1.5μl c1、稀释系数1∶7000sa-hrp)，选用cea、igg、psa和bsa这四种分析物，对检测afp的化学发光生物传感器进行特异性考察。实验选择分别在检测afp的化学发光生物传感器中添加10ng/mlafp等水平的以上四种分析物，再进行化学发光检测。如图3中的a结果显示，添加了afp的对照组δcl信号值大幅升高；而添加了cea、igg、psa和bsa组别的信号值基本不变，则δcl信号值几乎为零。推测是afp适体无法识别并特异性结合这四种分析物。同时，将这些干扰类似物与afp混合后，δcl信号值也能大幅升高。由此可知，本发明所设计的检测afp的化学发光生物传感器对afp具有良好的选择性。
76.另一方面，本发明对人血清样品中的afp进行加标回收实验，来评价检测afp的化学发光生物传感器的精密度。实验分别在稀释了50倍的人血清样品中添加了三个不同浓度
的afp浓度，然后通过检测afp的化学发光生物传感器进行化学发光检测。结果如表1所示，平均回收率在90.00～100.40％之间，重复三次测定，相对标准偏差在2.1～5.0％之间。由此可知，本发明设计的生物素标记的afp适体传感器具有较好的精密度，可行性较强，可用于实际样品中afp的定量分析。
77.表1样品中afp加标回收试验结果
[0078][0079]
3.3 atp标准曲线的建立
[0080]
在优化实验条件下(2μl磁珠、1.5μlc2)，利用该传感器对一系列不同浓度的atp进行化学发光检测，建立化学发光标准曲线如图2中的b所示。结果显示，atp浓度在5nm～100nm范围内，δcl信号值与atp浓度的对数值呈现非常好的线性关系，最低检测限为0.5nm(s/n＝3)。
[0081]
3.4检测atp的化学发光生物传感器的性能评价
[0082]
在优化实验条件下(2μl磁珠、1.5μlc2)，选用utp、ctp和gtp这三种分析物，对检测atp的化学发光生物传感器进行特异性考察。实验选择分别在检测atp的化学发光生物传感器中添加10ng/mlafp等水平的以上三种分析物，再进行化学发光检测。如图3中的b结果显示，添加了atp的对照组δcl信号值大幅升高；而添加了utp、ctp和gtp组别的信号值基本不变，则δcl信号值几乎为零。推测是atp适体无法识别并特异性结合这三种分析物。同时，将这些干扰类似物与atp混合后，δcl信号值也能大幅升高。由此可知，本发明所设计的检测atp的化学发光生物传感器对atp具有良好的选择性。
[0083]
另一方面，本发明对人血清样品中的atp进行加标回收实验，来评价检测atp的化学发光生物传感器的精密度。实验分别在稀释了50倍的人血清样品中添加了三个不同浓度的atp浓度，然后通过检测atp的化学发光生物传感器进行化学发光检测。结果如表2所示，平均回收率在98.56～100.24％之间，重复三次测定，相对标准偏差在3.4～6.3％之间。由此可知，本发明设计的检测atp的化学发光生物传感器具有较好的精密度，可行性较强，可用于实际样品中atp的定量分析。
[0084]
表2样品中atp加标回收试验结果
[0085][0086]
4实验结论
[0087]
本发明通过核酸适配体技术及磁性分离技术，设计了一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法。对于afp的检测，在优化实验条件下(4μl
磁珠、1.5μlcl、稀释系数1∶7000sa-hrp)，afp浓度在0.01ng
·
ml～10ng
·
ml-1
范围内，化学发光信号上升幅度(δcl信号值，y)与所测afp浓度(x)之间存在良好的线性关系，最低检测限为1.8pg
·
ml-1
(s/n＝3)。样品的平均加标回收率在90.00～100.40％之间，重复三次测定，相对标准偏差在2.1～5.0％之间。对于atp的检测，在优化实验条件下(2μl磁珠、1.5μlc2)，atp浓度在5nm～100nm范围内，化学发光信号上升幅度(δcl信号值，y)与所测atp浓度(x)之间存在良好的线性关系，最低检测限为0.5nm(s/n＝3)。样品的平均加标回收率在98.56～100.24％之间，重复三次测定，相对标准偏差在3.4～6.3％之间。本方法具有高精密度及高特异性，可用于实际样品中afp及atp的同步且高灵敏度快速检测。本发明为afp及atp的分析检测提供了一种新的思路，对实现多组分研究测定具有重大意义。
[0088]
实施例2
[0089]
一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，包括以下步骤：
[0090]
1)将apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
[0091]
2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
[0092]
3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1复合物；
[0093]
4)将步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
[0094]
5)将步骤4)所得固相与sa-hrp混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
[0095]
6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
[0096]
7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
[0097]
8)将步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
[0098]
9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
[0099]
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0100]
步骤1)包括以下步骤：分别取6μl、100μm的apt1、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
[0101]
步骤2)包括以下步骤：取10μl、10-8
μmafp和10μl、10-8
μmatp于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
[0102]
步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0103]
步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0104]
步骤3)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶
液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。
[0105]
步骤4)包括以下步骤：取步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0106]
步骤5)包括以下步骤：取100μlsa-hrp与步骤4)所得产物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得检测afp的化学发光生物传感器。
[0107]
步骤6)包括以下步骤：取步骤5)所得产物与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，检测化学发光cl值。
[0108]
步骤7)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0109]
步骤7)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0110]
步骤7)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。
[0111]
步骤8)包括以下步骤：取步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0112]
步骤9)包括以下步骤：取步骤8)所得产物与10μl四丁基溶液混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，检测化学发光cl值。
[0113]
实施例3
[0114]
一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，包括以下步骤：
[0115]
1)将单链apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
[0116]
2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
[0117]
3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1复合物；
[0118]
4)将步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
[0119]
5)将步骤4)所得固相与sa-hrp混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
[0120]
6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
[0121]
7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
[0122]
8)将步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
[0123]
9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
[0124]
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0125]
步骤1)包括以下步骤：分别取6μl、100μm的apt1、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
[0126]
步骤2)包括以下步骤：取10μl、10-8
μmafp和10μl、10-8
μmatp于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
[0127]
步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0128]
步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0129]
步骤3)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。
[0130]
步骤4)包括以下步骤：取步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0131]
步骤5)包括以下步骤：取100μlsa-hrp与步骤4)所得产物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得检测afp的化学发光生物传感器。
[0132]
步骤6)包括以下步骤：取步骤5)所得产物与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，检测化学发光cl值。
[0133]
步骤7)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0134]
步骤7)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0135]
步骤7)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。
[0136]
步骤8)包括以下步骤：取步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0137]
步骤9)包括以下步骤：取步骤8)所得产物与10μl四丁基溶液混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，检测化学发光cl值。
[0138]
实施例4
[0139]
一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，包括以下步骤：
[0140]
1)将apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
[0141]
2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
[0142]
3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1
复合物；
[0143]
4)将步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
[0144]
5)将步骤4)所得固相与sa-hrp混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
[0145]
6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
[0146]
7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
[0147]
8)将步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
[0148]
9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
[0149]
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0150]
步骤1)包括以下步骤：分别取6μl、100μm的apt1、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
[0151]
步骤2)包括以下步骤：取10μl、10-8
μmafp和10μl、10-8
μmatp于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
[0152]
步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0153]
步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0154]
步骤3)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。
[0155]
步骤4)包括以下步骤：取步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0156]
步骤5)包括以下步骤：取100μlsa-hrp与步骤4)所得产物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得检测afp的化学发光生物传感器。
[0157]
步骤6)包括以下步骤：取步骤5)所得产物与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，检测化学发光cl值。
[0158]
步骤7)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0159]
步骤7)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0160]
步骤7)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶
液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。
[0161]
步骤8)包括以下步骤：取步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0162]
步骤9)包括以下步骤：取步骤8)所得产物与10μl四丁基溶液混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，检测化学发光cl值。
[0163]
实施例5
[0164]
一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，可进一步推广到其他检测方法，包括以下步骤：
[0165]
1)将apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
[0166]
2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
[0167]
3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1复合物；
[0168]
4)将步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
[0169]
5)将步骤4)所得固相与sa-au混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
[0170]
6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
[0171]
7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
[0172]
8)将步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
[0173]
9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
[0174]
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0175]
步骤1)包括以下步骤：分别取6μl、100μm的apt1、apt2、s1、b、s2于1.5ml的离心管中，而后加入20μl的ba缓冲液，混匀后于80～100℃水浴锅中孵育4～6min，最后将其放于4℃冰箱过夜备用。
[0176]
步骤2)包括以下步骤：取10μl、10-8
μmafp和10μl、10-8
μmatp于步骤1)所得溶液，混匀后于35～39℃震荡反应40～60min。
[0177]
步骤3)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c1用量比为4∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c1，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0178]
步骤3)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0179]
步骤3)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c1复合物。
[0180]
步骤4)包括以下步骤：取步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，于35～39℃
震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0181]
步骤5)包括以下步骤：取100μlsa-au与步骤4)所得产物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得检测afp的化学发光生物传感器。
[0182]
步骤6)包括以下步骤：取步骤5)所得产物与50μl鲁米诺溶液混匀，移至测量瓶，而后加入50μl双氧水溶液，检测化学发光cl值。
[0183]
步骤7)包括以下步骤：取磁性微球，利用0.05～0.2m的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有edc的咪唑缓冲液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的c2用量比为2∶(1～2)(μg∶pmol)的比例加入氨基修饰的c2，于35～39℃震荡反应40～60min。
[0184]
步骤7)还包括以下步骤：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0185]
步骤7)还包括以下步骤：利用pbst缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的bsa溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用pbst缓冲溶液洗涤，即得磁性微球-c2复合物。
[0186]
步骤8)包括以下步骤：取步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用pbst缓冲溶液洗涤。
[0187]
步骤9)包括以下步骤：取步骤8)所得产物与10μl四丁基溶液混匀，移至测量瓶，而后加入90μlpg试剂，检测化学发光cl值。
[0188]
实施例6
[0189]
一种基于自组装dna核酸链传感器的多种肿瘤标记物化学发光快速检测方法，包括以下步骤：
[0190]
1)将apt1、apt2、s1、b、s2混匀，充分反应；
[0191]
2)将步骤1)所得产物与afp及atp混匀，充分反应；
[0192]
3)通过氨羧反应将氨基修饰的c1固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c1复合物；
[0193]
4)将步骤2)所得产物与磁性微球-c1复合物混匀，反应后取固相；
[0194]
5)将步骤4)所得固相与sa-hrp混匀，充分反应，即得检测afp的化学发光生物传感器；
[0195]
6)将检测afp的化学发光生物传感器与鲁米诺-h2o2试剂混匀，而后检测化学发光cl值；
[0196]
7)通过氨羧反应将氨基修饰的c2固定在羧基磁性微球的表面，得到磁性微球-c2复合物；
[0197]
8)将步骤4)反应的剩余溶液与磁性微球-c2复合物混匀，反应后取固相，即得检测atp的化学发光生物传感器；
[0198]
9)将检测atp的化学发光生物传感器与pg试剂混匀，而后检测化学发光cl值。
[0199]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。