一种骨髓组织脱钙用组合试剂及脱钙方法和应用与流程

1.本发明涉及一种骨髓组织脱钙用组合试剂及脱钙方法和应用，属于病理生物学技术领域。


背景技术：

2.骨髓活检(bmb)是病理检查重要的组成部分之一，其诊断报告是血液科等临床科室疾病诊疗的重要依据，其中fish在髓系肿瘤诊断、治疗监测和预后评判中发挥作用。但是骨髓组织不同于一般的软组织，是一种坚硬的结缔组织，含有大量矿化物质，给切片造成很大的难度。
3.骨髓组织标本的包埋目前主要以石蜡法为主，而石蜡法制作高质量的骨髓切片最重要的环节是标本组织的固定和脱钙。若骨髓标本组织未被充分固定，则在后续的环节中标本组织形态结构及细胞内各种成分就会被破坏；若标本组织脱钙不完全，则无法切出完整的石蜡切片，且在染色过程中容易掉片，容易人为地造成组织结构不完整。
4.目前常用的脱钙方法有edta螯合脱钙、电解法脱钙和酸脱钙，常用的脱钙液有两类：一类是无机酸，这类脱钙液脱钙速度较快，时间不易控制，需要不断针刺观察，容易脱钙过度，导致许多抗原和dna分子被破坏，对后续检测产生影响；另一类为温和脱钙液，如edta、有机弱酸等，但是脱钙速度慢耗时长，影响治疗的及时性。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种骨髓组织脱钙用组合试剂，与其他脱钙液相比，本发明的组合试剂利用粘多糖酶结合乙酸脱钙液，温和脱钙的同时又大大提高了骨髓组织脱钙的速度。
6.本发明的第二个目的是提供一种骨髓组织脱钙方法，用于解决现有技术中存在的样本切片不好，结构不清晰，抗原及核酸dna遭到破坏，脱钙时间过长等难以控制的问题。
7.本发明的第三个目的是提供骨髓脱钙用组合试剂在原位杂交方面的应用。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
9.一种骨髓组织脱钙用组合试剂，包括试剂a和试剂b；所述试剂a为粘多糖酶；所述试剂b为乙酸脱钙液。
10.本发明通过对骨髓组织结构组成的分析和已有骨髓组织脱钙技术的比较，将粘多糖酶与乙酸脱钙液相结合，对骨髓组织温和脱钙的同时，极大地缩短了脱钙的时间。
11.优选地，所述试剂a在使用时，粘多糖酶的浓度为1～1.5mg/ml。
12.该浓度的粘多糖酶可以很好地配合乙酸脱钙液完成骨髓组织快速温和的脱钙。
13.优选地，所述乙酸脱钙液以100ml计，包括：冰醋酸50ml、37％的甲醛溶液10ml和水40ml。
14.一种利用上述骨髓组织脱钙用组合试剂的骨髓组织脱钙方法，包括如下步骤：骨髓组织固定后，使用试剂a进行酶消化处理，再置于试剂b中进行脱钙至组织软化。
15.该方法能快速完成对骨髓组织脱钙的过程，操作步骤简单、试剂温和无污染、可操作性强，且不会过多的破坏骨髓组织中的抗原和核酸dna。
16.优选地，所述试剂a中粘多糖酶的浓度为1～1.5mg/ml。
17.粘多糖酶的浓度在此范围内，可将骨髓组织中的结缔组织充分消化，为后续骨髓组织脱钙做好基础。
18.优选地，所述酶消化处理的时间为20～30min。
19.优选地，所述脱钙至组织软化的时间一般为90min左右。
20.经粘多糖酶处理的骨髓组织在乙酸脱钙液中消化90min左右即可完成脱钙过程，且不会出现脱钙过度的现象。
21.骨髓组织脱钙用组合试剂在原位杂交方面的应用。
22.本发明的骨髓组织脱钙用组合试剂在进行骨髓组织脱钙时，反应温和且脱钙速度快，能更好的保护细胞中核酸dna免受酸破坏，保证原位杂交的杂交效果。
23.优选地，所述原位杂交为荧光原位杂交(fish)。
24.本发明的骨髓脱钙用组合试剂中的粘多糖酶可去除细胞间的结缔组织，可以更好的增加fish探针的杂交效果，而且粘多糖酶和乙酸脱钙液结合的温和脱钙法，保证骨髓组织完成脱钙的同时，细胞中核酸dna破坏较少，fish检测时荧光信号更明显。
附图说明
25.图1为本发明实施例6中edta螯合脱钙液脱钙的骨髓组织切片后fish检测图(1000x)；
26.图2为本发明实施例6中硝酸脱钙液脱钙的骨髓组织切片后fish检测图(1000x)；
27.图3为本发明实施例6中乙酸脱钙液脱钙的骨髓组织切片后fish检测图(1000x)；
28.图4为本发明实施例6中本发明组合试剂脱钙的骨髓组织切片后fish检测图(1000x)。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
30.edta脱钙液：
31.称取5.5g的edta，加入10％中性福尔马林100ml，充分溶解后备用。
32.硝酸脱钙液：
33.量取10ml的浓硝酸(68％)，向其中加入蒸馏水至100ml，充分混匀备用。
34.一、一种骨髓组织脱钙用组合试剂的具体实施例
35.本发明通过对骨髓组织结构组成的分析和已有骨髓组织脱钙技术的比较，将粘多糖酶和乙酸脱钙液相结合，制备一种骨髓组织脱钙用组合试剂，具体实施例如下：
36.实施例1
37.本实施例的骨髓组织脱钙用组合试剂1包括试剂a和试剂b，试剂a为浓度1mg/ml的粘多糖酶，试剂b为乙酸脱钙液。
38.乙酸脱钙液配制方法为：量取50ml冰醋酸，加入10ml甲醛溶液(37％)，最后加蒸馏
水至100ml，充分混匀。
39.实施例2
40.本实施例的骨髓组织脱钙用组合试剂2包括试剂a和试剂b，试剂a为浓度1.5mg/ml的粘多糖酶，试剂b为乙酸脱钙液。
41.乙酸脱钙液配制方法同实施例1所述。
42.二、一种骨髓组织脱钙方法的具体实施例
43.本发明的骨髓组织脱钙方法使用上述骨髓组织脱钙用组合试剂，脱钙温和且速度快，操作步骤简便，可操作性强，具体实施例如下：
44.实施例3
45.本实施例的骨髓组织脱钙方法使用本发明实施例1中的组合试剂1，具体方法如下：
46.1、取材：骨髓组织固定于10％福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。
47.2、固定：再以10％福尔马林固定。
48.3、酶处理：1mg/ml粘多糖酶消化30min。
49.4、脱钙：将组织置于乙酸脱钙剂中直至组织软化为止，一般为1.5h左右。
50.5、除酸：流水冲洗1小时。
51.然后即可进行常规的脱水，透明，浸蜡，切片过程。
52.实施例4
53.本实施例的骨髓组织脱钙方法使用本发明实施例2中的组合试剂2，具体方法如实施例3中所述，步骤3酶处理时粘多糖酶浓度为1.5mg/ml，消化时间为30min。
54.三、骨髓组织脱钙用组合试剂在原位杂交方面的应用的具体实施例
55.本发明的骨髓组织脱钙用组合试剂可以对骨髓组织快速温和的完成脱钙过程，相比于目前常用的脱钙液可以更好的保护核酸dna，脱钙后的骨髓组织切片后结构清晰，进行后续fish时，荧光信号较好。
56.实施例5
57.本实施例检测骨髓组织分别经3个不同浓度的粘多糖酶消化后，使用乙酸脱钙液脱钙，在脱钙的30min，60min，90min，120min，150min，180min使用物理法测试脱钙是否彻底。具体实施操作如下：
58.配制不同浓度梯度的粘多糖酶(0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml)，在骨髓组织放入乙酸脱钙液之前使用上述不同浓度的粘多糖酶消化30min，消化完成后使用清水清洗3次，每次3min，然后将组织置于乙酸脱钙液中。分别于30min，60min，90min，120min，150min，180min使用物理法测试脱钙是否彻底。
59.通过测试后发现1.5mg/ml和1mg/ml粘多糖酶消化后均需要90min完成脱钙，而0.5mg/ml粘多糖酶需要脱钙180min，几乎与无粘多糖酶消化的组织相当。所以，在骨髓组织放入乙酸脱钙液前使用1mg/ml-1.5mg/ml的粘多糖酶消化，再进行乙酸脱钙可以显著降低脱钙的时间。
60.实施例6
61.本实施例比对临床常用的edta螯合脱钙液、硝酸脱钙液、乙酸脱钙液和本发明实施例1的骨髓组织脱钙用组合试剂，比较常用的不同脱钙试剂的脱钙时间和脱钙效果，具体
实施操作如下：
62.6.1骨髓组织脱钙及切片制备
63.1、取适量骨髓组织置于10％的福尔马林中(溶液体积约为骨组织体积的30倍左右)，固定24h以上。
64.2、取出骨髓组织，用pbs漂洗3次，每次5min，连续锯下不超过0.5cm的厚度的薄骨片。
65.3、取3张薄骨片分别置于edta螯合脱钙液、硝酸脱钙液、乙酸脱钙液中，定时使用物理方法测试脱钙程度，如针刺，手掐，钳夹等方法，当骨组织变软或针刺时没有阻力感，即可终止脱钙；同时另取一张薄骨片先试用本发明实施例2的组合试剂2进行脱钙，先置于a试剂中消化30min，再置于b试剂中脱钙至骨髓组织软化。edta脱钙液一天测试一次，每天更换新的脱钙液，硝酸脱钙液和乙酸脱钙液一小时测试一次。
66.4、清水充分漂洗，一小时以上。
67.5、依次置于70％乙醇2h，80％乙醇1h，90％乙醇1h，95％乙醇1 1h，95％乙醇2 1h，无水乙醇1 1h，无水乙醇2 1h，无水乙醇3 1h。
68.6、然后依次放入二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3中浸泡，每次1h。
69.7、将石蜡融化，温度保持在55℃左右，将组织浸泡在石蜡中，第一次30min，第二次60min，第三次60min。注意保持温度，防止凝固。
70.8、将组织放入盛有石蜡液的模具中，所需组织切面与底部平行，因石蜡液在冷环境中易凝固，此步尽量要快。
71.6.2 fish检测
72.6.2.1骨髓切片处理
73.1、将制备好的蜡块切片，捞于粘附性玻片上，56-65℃左右烤片三小时以上。
74.2、提前预热胃蛋白酶处理液，使其温度达到37℃保温备用。
75.3、二甲苯中室温放置切片10分钟，重复该步骤两次。
76.4、无水乙醇中室温放置切片5分钟，重复该步骤一次。
77.5、依次85％、70％乙醇中室温处理切片3分钟。
78.6、去离子水洗2分钟，重复3次。
79.7、用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后，然后使其处于保温状态，放入切片修复20分钟，或是在高压锅内加入适量的预处理缓冲液，高压修复5分钟。
80.8、取出玻片，用去离子水洗涤三次。将切片直接放入蛋白酶消化液中，消化15
±
10分钟。
81.注：根据不同的组织(细胞)类型及切片厚度，消化时间有所不同，一般来讲，建议预实验找到样本的最佳消化时间。
82.9、去离子水清洗2分钟，三次。
83.10、脱水：70％，85％，100％乙醇溶液中依次处理各2分钟，晾干。
84.6.2.2标本变性与杂交
85.1、将配制好的her2探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器取10μl至各个样本。滴加至目标区域。
86.2、样本盖上盖玻片，避免气泡；封片胶封片。
87.3、将玻片放入杂交仪，80℃(
±
2℃)变性6分钟，40℃过夜杂交(建议使用82℃变性6分钟，40℃杂交过夜)。
88.注意：杂交期间片子不能干！
89.6.2.3杂交后处理
90.1、提前30分钟将洗涤液i水浴加热到73
±
1℃，小心除去封片胶。
91.2、将切片置于洗涤液ii溶液中，放置5-10分钟，除去盖玻片。
92.3、将切片置于洗涤液i洗液(水浴加热到73
±
1℃)中，上下提拉切片1-3s，放置分钟。
93.4、室温条件下，将切片置于洗涤液ii洗液中，上下提拉1-3s，处理切片2分钟。
94.5、在70％、85％的乙醇溶液中依次放置2分钟。
95.6、避光晾干样本。
96.注：考普林缸中每次最好同时放置4张切片，当最后一张玻片放入考普林缸时开始计时。
97.6.2.4观察
98.1、滴加10μl dapi复染液到切片组织上，盖上盖玻片，避免气泡，暗处-20℃处理15分钟。
99.2、切片在荧光显微镜下观察计数。
100.3、长期保存应放于-20℃。
101.经过测试得知，edta脱钙液完全脱钙至少需要2周左右，硝酸脱钙液需要3h以上，乙酸脱钙液需要3h以上，而本技术的试剂组合仅需2.5h即可完脱钙的过程。
102.her2探针杂交结果如图1-4所示，由图中可以看出，使用本发明的骨髓脱钙用组合试剂脱钙后骨髓组织切片的fish效果最优，荧光信号亮度明显优于其余三种脱钙液处理的骨髓组织。
103.综上所述，本发明的骨髓组织脱钙用组合试剂相比于常用的脱钙液，具有脱钙时间短、温和脱钙的优点，能快速完成脱钙的同时，最大程度的减少核酸dna的破坏，保证了后续fish实验的顺利进行。
104.最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。