同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及激素检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法及试剂盒。


背景技术：

2.血液中的睾酮存在游离睾酮和总睾酮两种形式，其中，血液中大约98％的睾酮与蛋白结合形成总睾酮，仅约2％是以游离睾酮形式存在。总睾酮水平与特发性男性性早熟、家族性男性性早熟、肾上腺皮质增生、肾上腺皮质肿瘤、男性睾丸发育不全、无睾征、下丘脑或者垂体性的性腺功能减低等疾病息息相关，而游离睾酮是有活性的状态，测定人体内游离睾酮水平可反映人体生物活性睾酮水平的高低。研究表明，游离睾酮的检测更适合用于研究女性的性腺功能障碍、高雄激素、男性的性发育和青春期障碍、多囊卵巢综合征等。因此，游离睾酮的测量对于男性生育和女性疾病诊断都有非常重要的意义。
3.目前，临床常用免疫法和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)检测总睾酮浓度，而游离睾酮的检测则是通过计算得到，即分别测总睾酮浓度和性激素结合蛋白浓度，然后通过计算得到游离睾酮浓度，然而由于性激素蛋白或白蛋白除了与睾酮结合，还会与皮质醇等其他类固醇激素结合，因此，利用计算得到的游离睾酮浓度难以反映真实的游离睾酮值。随着现代技术的发展，通过超滤或平衡透析的前处理手段结合lc-ms/ms可用来检测血液中的游离睾酮，且正在逐渐被临床检测使用，但这种技术仅能用于测定游离睾酮的含量，而不能测定总睾酮的含量。
4.鉴于总睾酮和游离睾酮在人体内的重要地位，对其准确定量有助于辅助诊断相关疾病。然而，单一的游离睾酮检测已经具有很大的挑战，同时进行睾酮和游离睾酮的检测将更有挑战性。因此，如何设计检测方法，以获得同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的有益效果是值得深思的。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
6.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，包括以下步骤：
7.步骤一、将血液样本分成a、b两部分样本，在a样本中加入萃取液经振荡、离心、取上层清液、浓缩上层清液得到样本总睾酮溶液，其中，所述萃取液中含有睾酮的同位素内标物；
8.步骤二、b样本经平衡透析得到游离睾酮透析液，在所述游离睾酮透析液中加入睾酮的同位素内标物，然后在加热条件下进行衍生化反应，在衍生化反应结束后的游离睾酮透析液中加入萃取液经液液萃取、离心、取上层清液并浓缩，得到样本游离睾酮溶液；
9.步骤三、加入复溶溶液复溶步骤一中的所述样本总睾酮溶液和步骤二中的所述样本游离睾酮溶液并混合均匀，得到样本总溶液；
10.步骤四、用睾酮标准品分别配制多种标曲浓度梯度的总睾酮标曲溶液和游离睾酮标曲溶液，并加入睾酮的同位素内标物，用lc-ms/ms技术测定每个标曲浓度下对应的睾酮及其内标峰面积，以标曲浓度、睾酮及其内标峰面积比进行线性回归，得到总睾酮标准曲线和游离睾酮标准曲线，通过lc-ms/ms同时检测得到所述样本总溶液中的总睾酮及其内标峰面积比、游离睾酮及其内标峰面积比，并代入所述标准曲线计算得到所述样本总溶液中的总睾酮和游离睾酮的含量，其中，配制游离睾酮标曲溶液时睾酮标准品的处理方法与步骤二中所述游离睾酮透析液的处理方法相同。
11.优选的是，其特征在于，步骤二中的所述平衡透析操作的温度为37℃，平衡透析时间为4～16h，所述平衡透析操作采用的缓冲液为ph＝7.4的hepes缓冲液。
12.优选的是，其特征在于，步骤二中所述衍生化反应的温度为60～80℃，所述衍生化反应的时间为40～70min，所述衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺的甲醇水溶液、甲氧基胺的甲醇水溶液中的任意一种，所述衍生化试剂的浓度为0.02～0.06mol/l，所述甲醇水溶液中的甲醇质量分数为20％～80％。
13.优选的是，其特征在于，步骤一和步骤二中的所述浓缩操作采用氮气吹干、真空离心干燥浓缩方式中的任意一种。
14.优选的是，其特征在于，步骤二中所述液液萃取操作中采用甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚中任意一种，或多种组合形成的混合液为萃取液。
15.优选的是，其特征在于，步骤二中的所述复溶溶液为甲醇、乙腈中的任意一种。
16.优选的是，其特征在于，步骤二中的所述平衡透析采用的是96孔平衡透析板。
17.优选的是，其特征在于，所述lc-ms/ms采用色谱条件为：流动相ⅰ为甲酸的水溶液，流动相ⅱ为甲酸的甲醇溶液，进行梯度洗脱，其中，流动相ⅰ和流动相ⅱ形成了液相洗脱试剂。
18.优选的是，其特征在于，所述样本包含人血液样本、质控样本和睾酮标准品，其中，所述质控样本采用三个质控浓度，分别为由混合成年男性血液样本制备得到的高浓度质控样本、由成年男性与成年女性血液样本按照一定比例混合制备得到的中浓度质控样本及由混合成年女性血液样本制备得到的低浓度质控样本。
19.提供一种基于所述的测定方法的试剂盒，包含标准曲线工作液，质控样本、内标工作液、缓冲液、衍生化试剂和液相洗脱试剂，其中，所述标准曲线工作液由所述睾酮标准品用所述缓冲液配制得到，所述内标工作液由所述睾酮的同位素内标物用所述缓冲液配置得到。
20.本发明至少包括以下有益效果：
21.第一、本发明提供的测定方法可以通过将样品总溶液单次进样用lc-ms/ms技术即可同时测定血液中总睾酮和游离睾酮的含量，而减少使用lc-ms/ms三重串联液质联用仪的检测次数以及测定所需的时间，具有较高的临床应用价值。
22.第二、本发明提供的测定方法将游离睾酮检测灵敏度显著提升至0.5pg/ml，满足女性游离睾酮含量检测的临床需求。
23.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
24.图1为本发明的其中一种技术方案的所述测定方法的流程图；
25.图2为本发明的其中一种技术方案的血液中总睾酮和游离睾酮的总离子流图；
26.图3为本发明的其中一种技术方案的血液中总睾酮的提取离子流图；
27.图4为本发明的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的提取离子流图；
28.图5为本发明的其中一种技术方案的血液中总睾酮的标准曲线；
29.图6为本发明的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的标准曲线；
30.图7为本发明的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的检测限图；
31.图8为本发明的其中一种技术方案的血液中总睾酮的检测限图；
32.图9为本发明的其中一种技术方案的衍生化的游离睾酮未经萃取直接与样本总睾酮溶液复溶混合后，衍生化游离睾酮浓度与起始浓度比值的变化曲线图；
33.图10为本发明的其中一种技术方案的衍生化的游离睾酮经萃取后与样本总睾酮溶液复溶混合后，衍生化游离睾酮浓度与起始浓度比值的变化曲线图。
具体实施方式
34.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
35.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
36.《实施例》
37.步骤一、取100μl待测血液样本，加入400μl 1ng/ml含睾酮的同位素内标物(睾酮-13
c3)的甲醇溶液，用涡旋振荡器于2000
×
g、室温条件下振荡5min，然后用离心机于14000
×
g、10℃条件下离心10min，取上层清液，并将上层清液于1300
×
g、30℃条件下经真空干燥得到样本总睾酮溶液；
38.步骤二、取200μl待测血液样本于透析样本池中，在用透析膜隔开的另一个透析缓冲池中加入400μl ph＝7.4的hepes缓冲液，于37℃、250rpm条件下经4h达到平衡状态，在透析缓冲池中得到游离睾酮透析液，取150μl游离睾酮透析液，依次向游离睾酮透析液中加入10μl睾酮的同位素内标物(睾酮-13
c3)、140μl 0.04mol/l盐酸羟胺的甲醇水溶液，其中，甲醇水溶液中的甲醇质量分数为60％，并于65℃、600rpm的条件下衍生化反应60min，衍生化反应结束后，将衍生化反应结束后的游离睾酮透析液于2～8℃冰箱中冷却10min，然后取出并加入100μlh2o，再加入600μl甲基叔丁基醚进行液液萃取后，用涡旋振荡器于2000
×
g、室温条件下振荡5min之后，用离心机于14000
×
g、10℃条件下离心10min，取上层清液，并将上层清液于1300
×
g、30℃条件下经真空干燥得到样本游离睾酮溶液；
39.步骤三、用200μl甲醇复溶步骤一中的样本总睾酮溶液后，并用其去复溶步骤二中得到的样本游离睾酮溶液，并于2000
×
g条件下涡旋振荡均匀、14000
×
g、10℃条件下离心10min、取上层清液，得到样本总溶液；
40.步骤四、用缓冲液溶解市售不含游离激素的睾酮标准品得到标准曲线工作液，并用标准曲线工作液分别配制多种梯度浓度的总睾酮标曲溶液和游离睾酮标曲溶液，取100μl不同浓度的标曲溶液于至96孔进样板中，加入10μl由所述睾酮的同位素内标物用所述缓冲液配置得到的内标工作液；取110μl样本总溶液于96孔进样板中，将96孔板转移至lc-ms/ms仪器(超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪)中，进样分析，
41.其中，总睾酮标曲溶液与游离睾酮标曲溶液由缓冲液稀释标准曲线工作液配制而成，且所述游离睾酮标曲溶液需要经过与步骤二相同的加热衍生化反应、液液萃取操作，其对应得标曲浓度如下表1所示：
42.表1总睾酮与游离睾酮得标曲浓度
43.标曲溶液浓度1浓度2浓度3浓度4浓度5浓度6浓度7浓度8总睾酮(ng/ml)00.20.525102030游离睾酮(pg/ml)01.5510251002501000
44.本实施例中，lc-ms/ms法色谱分离条件为：
45.色谱柱为beh超高效色谱分离柱c18，填料粒径为1.7μm，内径为2.1mm，柱长为50mm；
46.柱温为40℃；
47.流动相ⅰ为0.1％甲酸的水溶液，流动相ⅱ为0.1％甲酸的甲醇溶液，采用反相色谱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如表2所示：
48.表2梯度洗脱程序
[0049][0050][0051]
本实施例中，lc-ms/ms法质谱条件为：
[0052]
采用电喷雾离子源正离子模式，其中，离子源温度为550℃，雾化器气压为50psi，辅助气压为50psi，气帘气为35psi，喷雾电压为5500v；
[0053]
采用多反应监测模式，具体检测母离子/子离子对及其对应的保留时间、去簇电压、入口电压、碰撞能量如下表3所示，其中，带“*”的离子为定量离子，未带“*”的离子为定性离子：
[0054]
表3反应过程中各物质的监测数据
[0055][0056]
根据总睾酮标曲溶液以及游离睾酮标曲溶液的检测结果，分别以标曲溶液浓度为横坐标，以总睾酮或游离睾酮及其内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得总睾酮标准曲线如附图5所示和游离睾酮标准曲线如附图6所示，其中，总睾酮在0～30ng/ml浓度范围内有良好的线性关系，相关系数》0.998，相关线性回归方程详见附图5，游离睾酮在0～1000pg/ml浓度范围内有良好的线性关系，相关系数》0.997，相关线性回归方程详见附图6。
[0057]
根据质谱检测到样本总溶液的总睾酮及其内标峰面积比值、游离睾酮及其内标峰面积比值，并将比值分别代入对应的标准曲线方程，计算得到血液中总睾酮和游离睾酮的含量，采用本实施例提供的总睾酮和游离睾酮含量的检测方法，实现了同时测定人血液样本中总睾酮和游离睾酮含量的有益效果，且具有总睾酮和游离睾酮的检测限分别为0.05ng/ml和0.5pg/ml的有益效果。
[0058]
《质控样本的方法验证》
[0059]
一、检测准确度和精密度
[0060]
选取高、中、低三个不同浓度水平的质控样本，按照实施例的方法进行处理，且每个浓度水平的质控样本单批次平行测定10次，单次进样检测其总睾酮和游离睾酮的含量，并计算检验检测结果的准确度和精密度，检测结果如下表4和表5所示，其中，高浓度质控样本由混合成年男性血液样本制备得到、中浓度质控样本由成年男性与成年女性血液样本按照1：1比例混合制备得到，低浓度质控样本由混合成年女性血液样本制备得到：
[0061]
表4总睾酮准确度和精密度的检测表
[0062]
[0063][0064]
表5游离睾酮准确度和精密度的检测表
[0065]
[0066][0067]
根据表4和表5可知，不同浓度的质控样本按照实施例的方法所得检测结果，cv小于15％，在可接受范围之内，表明该评估检验方法的准确度及精密度完全满足要求。
[0068]
《对比例》
[0069]
采用实施例相同的方法测定血液中总睾酮和游离睾酮的含量，不同的是，步骤二中的衍生化反应结束后的游离睾酮透析液不加入甲基叔丁基醚进行液液萃取，而是直接经振荡、离心、真空干燥得到样本游离睾酮溶液。
[0070]
将实施例和对比例处理得到的两个样本总溶液于10℃放置，并监测其衍生化的游离睾酮浓度与初始游离睾酮浓度的比值，发现经对比例处理得到的样本总溶液中衍生化的游离睾酮浓度与初始游离睾酮浓度的比值在放置3h后就不断地升高，而经实施例处理得到的样本总溶液中衍生化的游离睾酮浓度与初始游离睾酮浓度的比值在放置6天(144h)内无显著变化，分析原因，可能是因为对比例中未经甲基叔丁基醚萃取的衍生化试剂会在与样本总睾酮溶液复溶混合后将其中的总睾酮进一步反应，生成更多的衍生化游离睾酮，而从影响其比值，因此，对步骤二中的衍生化反应结束后的游离睾酮透析液进行萃取，可以去掉
多余的衍生化试剂，从而实现准确检测睾酮和游离睾酮含量的有益效果。
[0071]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
[0072]
如图2、图3、图4、图7、图8所示，intensity，cps表示以每秒计数为单位的离子强度，time，min表示以分钟为单位的时间；如图5和图6所示，英文释意如下：area ratio为面积比，concentration ratio为浓度比。