一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法

本发明属于生物聚合物相互作用领域，具体为一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法。

背景技术：

1、作为复杂的异质结构，多糖和蛋白质共同存在于许多食品体系中，有助于改善食品的机械稳定性、功能性和质地外观。例如在现如今的乳品行业中，为了制备多种形态、质地的乳制品而引入多糖以提高稳定性，这也成为了现如今乳品行业最具技术性的问题。酪蛋白作为牛奶中含量最多的蛋白质，通过形成酪蛋白胶束以维持酪蛋白的完整性和稳定性。因此，通过调整牛奶中酪蛋白胶束的状态来控制乳制品的质地和稳定性。多糖的使用大多数是较为常见的阴离子多糖与酪蛋白相互作用以提高稳定性。而壳聚糖作为自然界中唯一的天然阳离子多糖，因其独特的理化性质和生物学功能也被引入用作酪蛋白胶束的稳定剂。

2、多糖/蛋白质在水溶性分散体中的静电吸引通常表现为多样化的方式，如产生可溶性复合物、均匀的弱凝胶、聚合物结合的沉淀等。影响多糖和蛋白质发生相互作用的探究多数集中在ph值、离子强度、电荷密度、浓度等条件，对多糖的分子量对相互作用产生的影响鲜少关注。随分子量的增加降低了取向自由度，限制了熵对系统中整体自由能的贡献。分子量的改变影响了多糖和蛋白质在溶液中的流体动力学体积，进而影响了多糖-蛋白质的络合和共凝。酪蛋白胶束中大量的电负性区域与酸性介质中携带大量正电荷的壳聚糖也使拓展以壳聚糖为乳制品稳定剂的影响更为重要。

3、现有技术中，多糖和蛋白质混合后才能检测它们之间发生的相互作用，无法实时体现壳聚糖分子量效应对以壳聚糖为乳制品稳定剂的体系的影响。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种与有序多孔层干涉系统的无损非标记技术相结合、动态量化同质和异质界面的实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法。

2、技术方案：本发明所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，包括如下步骤：

3、(a)制备质量体积比为0.6～1.0％的单分散二氧化硅微球乙醇组装溶液；

4、(b)用食人鱼洗液亲水化处理基底载玻片，在75～85℃加热2～3h并用余热保温30～40min，冲洗，烘干，竖直插入步骤(a)制得的组装溶液中生长，得到二氧化硅胶体晶体薄膜；

5、(c)将步骤(b)制得的二氧化硅胶体晶体薄膜置于倒置光学显微镜载物台上，调节光斑聚焦在薄膜上，通过物镜收集反射光经光纤输入至光纤光谱仪，连接电脑，获得二氧化硅胶体晶体薄膜的反射干涉光谱，通过极值跟踪法计算转换成动态变化的光学厚度；

6、(d)将壳聚糖溶液匀速泵入与步骤(c)制备的薄膜进行物理吸附，反应结束后通入醋酸钠缓冲液，去除弱结合或未结合的壳聚糖分子，获得实时的反射干涉光谱，通过极值跟踪法计算转换成动态变化的光学厚度；

7、(e)将酪蛋白溶液匀速注入经步骤(d)壳聚糖功能化薄膜上，与其进行相互作用，反应结束后通入醋酸钠缓冲液实时采集反射干涉光谱，通过极值跟踪法计算转换成动态变化的光学厚度，来反应壳聚糖与酪蛋白间的相互作用信息。

8、进一步地，步骤(a)中，二氧化硅微球的直径为110～280nm。

9、进一步地，步骤(b)中，冲洗为依次用蒸馏水、去离子水与无水乙醇各冲洗5～6次，烘干的温度为110～120℃。生长的温度为20～25℃，湿度为8～12％，时间为7～8天。二氧化硅胶体晶体薄膜的厚度为4～6μm。

10、进一步地，步骤(c)中，反射干涉光谱的测试原理如下：

11、根据一定角度的入射光线i照射在薄膜上经由上下表面反射光线的叠加后获得的公式可知：

12、

13、iλ的极大值出现在2nd/λ＝m处，m＝0,1,2…。这就是著名的fabry-perot薄膜干涉公式：mλ＝2nd。其中n为薄膜整体的平均折射率，d为薄膜厚度，λ为波长。因此，当n或d的任何变化都会导致干涉峰波长的迁移。对于多孔型二氧化硅胶体晶体薄膜干涉基底带来的较大比表面积，使得多数待分析物的结合与解离都在孔隙内与表面发生，带来的主要改变为薄膜平均折射率n的变化。而同时待分析物与二氧化硅胶体晶体薄膜的结合与解离也改变了薄膜的物理厚度d，经由薄膜上下表面反射光之间的光程差导致了干涉峰的迁移。

14、进一步地，步骤(d)中，壳聚糖溶液的制备方法为，将30～300kda分子量的壳聚糖，配制成质量体积比为0.4～0.8％、ph为4～6的壳聚糖溶液。壳聚糖溶液匀速泵入的速度为0.1～0.3ml/min，优选为0.2ml/min。

15、进一步地，步骤(e)中，酪蛋白溶液的质量体积比为1～2％，ph为4～6。相互作用信息包括可溶性复合物的产生、均匀弱凝胶的产生、聚合物结合的沉淀。为引入多糖以改善乳制品在加工过程中的稳定性提供了研究支持，将有可能帮助选择基于多糖的参数，以设计各种形式的产品用于乳制品制造领域。酪蛋白溶液注入的速度为0.2ml/min。

16、进一步地，极值跟踪法根据法布里-珀罗干涉公式mλ＝2nd计算转换，其中，m为相对阶数，λ为波长，nd为光学厚度。

17、设计原理：如图1，基于垂直沉积法，利用单分散二氧化硅球提供良好的周期性阵列结构制备规则有序的二氧化硅胶体晶体薄膜干涉基底。通过使用不同分子量壳聚糖对二氧化硅胶体晶体薄膜功能化，进一步实时动态的探究与酪蛋白间发生的相互作用过程，不同理化参数的条件光学厚度发生了显著的改变，揭示分子量对壳聚糖-酪蛋白复合物结构和对稳定性的影响。醋酸钠缓冲液去除弱结合或未结合的壳聚糖分子。

18、有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：

19、1、利用有序多孔层干涉系统对不同分子量的壳聚糖和酪蛋白的相互作用过程进行测量，能够更灵敏且实时的获得相关信息，为获得壳聚糖/酪蛋白和其他生物聚合物在不同条件变量下的相互作用提供了更多的可能性；

20、2、关于不同分子量的壳聚糖-酪蛋白复合物的结果，为引入多糖以改善乳制品在加工过程中的稳定性能够提供研究支持；

21、3、二氧化硅胶体晶体薄膜制备简单，重复性好，制备条件易于控制，光学性质明显，可大批量生产；

22、4、对同质和异质界面的多糖与蛋白质之间的相互作用过程测量方法更加准确及时，精度高且稳定性强，一开始混合即可实时分析其相互作用，便于后续调整。

技术特征：

1.一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(a)中，二氧化硅微球的直径为110～280nm。

3.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(b)中，冲洗为依次用蒸馏水、去离子水与无水乙醇各冲洗5～6次，烘干的温度为110～120℃。

4.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(b)中，生长的温度为20～25℃，湿度为8～12％。

5.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(b)中，二氧化硅胶体晶体薄膜的厚度为4～6μm。

6.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(d)中，壳聚糖溶液的制备方法为，将30～300kda分子量的壳聚糖，配制成质量体积比为0.4～0.8％、ph为4～6的壳聚糖溶液。

7.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(d)中，壳聚糖溶液匀速泵入的速度为0.1～0.3ml/min。

8.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(e)中，酪蛋白溶液的质量体积比为1～2％，ph为4～6。

9.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述步骤(e)中，相互作用信息包括可溶性复合物的产生、均匀弱凝胶的产生、聚合物结合的沉淀。

10.根据权利要求1所述的一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，其特征在于：所述极值跟踪法根据法布里-珀罗干涉公式mλ＝2nd计算转换，其中，m为相对阶数，λ为波长，nd为光学厚度。

技术总结
本发明公开了一种实时分析壳聚糖与酪蛋白相互作用的测试方法，包括如下步骤：制备单分散二氧化硅微球乙醇组装溶液；用食人鱼洗液亲水化处理基底载玻片，冲洗，烘干，竖直插入组装溶液中生长，得到二氧化硅胶体晶体薄膜；将二氧化硅胶体晶体薄膜置于倒置光学显微镜载物台上，调节光斑聚焦在薄膜上，获得二氧化硅胶体晶体薄膜的反射干涉光谱，转换成光学厚度；将壳聚糖溶液匀速泵入与薄膜物理吸附，结束后通入醋酸钠缓冲液，获得反射干涉光谱，转换成光学厚度；将酪蛋白溶液注入薄膜上，相互作用结束后通入醋酸钠缓冲液实时采集反射干涉光谱，转换成光学厚度。本发明能更灵敏且实时获得相关信息，二氧化硅胶体晶体薄膜光学性质明显，可大批量生产。

技术研发人员：钱卫平,马宁
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11