昆布产品HPLC特征图谱的构建方法及其应用与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种昆布产品hplc特征图谱的构建方法及其应用。

背景技术：

1、昆布为海带科植物海带laminaria japonicaaresch.或翅藻科植物昆布eckloniakurome okam.的干燥叶状体，其性寒，味咸，具有消痰软坚散结、利水消肿的功效，用于治疗瘿瘤、瘰疬、睾丸肿痛、痰饮水肿。

2、作为一味应用历史悠久的药食两用中药，前人对昆布的化学组成、药理作用和临床应用开展了许多研究。2020年版中国药典一部收载的昆布质量标准中仅测定了碘和多糖的含量，不能实现对昆布产品整体质量进行准确描述和评价。李蓉首次建立的海带hplc参考指纹图谱可用于海带药材的真伪鉴别(参见李蓉，唐旭利，张敏，李国强，王长云，管华诗.海洋药用生物系列hplc化学指纹图谱研究ⅰ.海带药材的hplc化学指纹图谱[j].中国海洋大学学报(自然科学版)，2009，39(s1)：37-41.)。后黄华花利用uplc指纹图谱结合化学模式识别技术对昆布进行质量评价(参见黄华花，张怡评，吕诗诗.昆布uplc指纹图谱及化学模式识别研究[j].中药材，2020，43(07)：1651-1655.)。现有方法有效分离的成分较少，构建的特征图谱的特征峰数量较少，不能全面监控昆布产品的质量。现有方法不能对昆布及其制剂中极性较大的成分进行特征图谱检测，如昆布标准汤剂是由昆布药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉，故标汤中大多为水提取出的极性较大的成分，无法用该特征图谱方法进行检测。

3、针对现有的检测昆布特征图谱方法只适用于检测海带饮片真伪，而海带标准汤剂是由昆布药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉，所含成分极性较大，现有方法无法对其进行检测。且现有特征图谱方法供试品制备方法时间过久、操作繁琐、指认特征峰无归属，无法对昆布及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。因此，有必要建立一种昆布产品的质量控制方法，为有效控制和较全面评价昆布及其制剂的质量提供依据。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种昆布产品hplc特征图谱的构建方法及其应用，可以有效控制和较全面的评价昆布产品的质量。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、昆布产品hplc特征图谱的构建方法，包括以下步骤；

4、s1、昆布供试品溶液的制备；

5、s2、参照物溶液的制备；

6、s3、对照品溶液的制备；

7、s4、高效液相色谱测定：吸取步骤s1制备的昆布供试品溶液、步骤s2制备的参照溶液和步骤s3制备的对照品溶液注入高效液相色谱，得到hplc特征图谱。

8、本发明中的昆布供试品包括昆布药材、昆布饮片、昆布标准汤剂、昆布干膏粉或昆布配方颗粒。

9、本发明中所述昆布供试品溶液的制备为：称取昆布供试品，精密加入体积百分数10％的甲醇制备成昆布供试品溶液。具体地，所述制备方法为：精密称取昆布供试品，精密加入体积百分数10％甲醇，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用体积百分数10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

10、优选地，所述昆布供试品溶液的制备为：精密称取昆布供试品，精密加入10％甲醇20-50ml，超声处理30-90分钟，超声处理的功率为250w-800w，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

11、最优选地，所述昆布供试品溶液的制备为：精密称取昆布供试品，精密加入10％甲醇50ml，超声处理30分钟，超声处理的功率为250w，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

12、本发明中参照物为昆布对照药材，所述参照物溶液的制备为：取昆布对照药材，加体积百分数10％的甲醇制备成参照物溶液。具体地，所述制备方法为：取昆布对照药材，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇，超声处理，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

13、优选地，所述参照物溶液的制备为：取昆布对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇30ml，超声处理30分钟，超声功率250w，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

14、本发明中的对照品为尿苷、腺苷、尿嘧啶和鸟苷，所述对照品溶液的制备为：取尿苷、腺苷、尿嘧啶及鸟苷对照品适量，加体积百分数10％的甲醇制备成混合溶液，作为对照品溶液。具体地，所述制备方法为：取尿苷、腺苷、尿嘧啶及鸟苷对照品适量，加10％甲醇制成每1ml各含10μg的混合溶液，作为对照品溶液。

15、优选地，步骤s4中所述高效液相色谱的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比3：2的乙腈和甲醇混合液为流动相a，体积百分数0.1％的磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱。

16、进一步优选地，所述梯度洗脱的条件如下：

17、

18、优选地，步骤s4中所述高效液相色谱的色谱条件为：流速为每分钟0.7-0.9ml/min；柱温为23-27℃；检测波长为230-320nm。

19、进一步优选地，步骤s4中所述高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以体积比3：2的乙腈和甲醇混合液为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7-0.9ml/min；柱温为23-27℃；检测波长为230-320nm；理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。

20、最优选地，步骤s4中所述高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以体积比3：2的乙腈和甲醇混合液为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml/min，柱温为25℃；检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。

21、优选地，步骤s4采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由6个特征峰构成的对照特征图谱，其中，2号峰为尿嘧啶峰，4号峰为尿苷峰，5号峰为腺苷峰，6号峰为鸟苷峰，1号峰和3号峰为共有峰。

22、进一步优选地，以腺苷峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间的比值为：0.37-峰1、0.39-峰2、0.52-峰3、0.87-峰4、1.32-峰6。

23、本发明还提供了上述的构建方法在昆布产品质量控制中的应用。

24、优选地，本发明中的昆布产品为昆布药材、昆布饮片、昆布标准汤剂、昆布干膏粉或昆布配方颗粒。

25、优选地，所述应用可同时针对尿苷、鸟苷、尿嘧啶和腺苷的含量对昆布产品的质量进行定量控制。

26、本发明的有益效果为：

27、(1)本发明提供的昆布产品hplc特征图谱的构建方法，同时实现了尿苷、鸟苷、尿嘧啶和腺苷各评价指标成分的共同控制，同时构建得到的对照特征图谱中含有6个共有特征峰，显著提升了特征峰的数量，能够有效提升昆布产品特征图谱的精确度，达到昆布产品整体质量控制的目的。

28、(2)本发明提供的昆布产品hplc特征图谱的构建方法，对供试品溶液制备过程进行优化，采用在供试品中加入10％甲醇提取完全，检测成分含量相对较高，各特征峰分离效果相对较好，峰形佳。

29、(3)本发明提供的昆布产品hplc特征图谱的构建方法，进一步优化获得特征图谱的色谱条件，包括流动相的优化，以及梯度洗脱程序的优化，最终选用乙腈-甲醇(3：2)-0.1％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以尿嘧啶、尿苷、腺苷、鸟苷为参照物，能够有效改善峰形，提高色谱峰分离度，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高、分析速率快，能够全面、清楚、有效地对昆布产品的质量进行控制。

30、(4)本发明还提供了上述的构建方法在昆布产品质量控制中的应用，所述应用可同时针对尿苷、鸟苷、尿嘧啶和腺苷的含量进行定量控制。并且，通过本发明还能有效实现物质传递过程的质量控制，具体为：可以有效实现配方颗粒制备过程中中间品的质量控制，有效使最终制备得到的昆布配方颗粒的成分能够与昆布药材、饮片、标准汤剂、提取液、浸膏、干膏粉中基本一致。