奶牛血液的脂质组学标志在奶牛酮病敏感度检测中的应用

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1.本发明涉及奶牛体外检测技术领域，具体涉及奶牛血液的脂质组学标志在奶牛酮病敏感度检测中的应用。


背景技术：

2.奶牛酮病属于奶牛围产期营养代谢性疾病，主要是由于奶牛体内碳水化合物和挥发性脂肪酸代谢紊乱，造成体内糖和生糖物质的大量不足，以致难以维持机体内正常的营养代谢而造成的体脂的加速分解。奶牛低血糖时会引起脂肪组织中脂肪的大量动员，其结果大量游离脂肪酸(ffa)进入血液，血中ffa浓度升高，并通过血液进入其他组织。当大量ffa进入肝脏时，肝中ffa的浓度也增高，β-氧化作用增强，因而乙酰辅酶a的生成量增加；同时由于糖的缺乏、不能由糖产生更多的α-磷酸甘油，并且脂肪组织中动员出的甘油，也大部分沿糖的异生途径进行代谢，这样，肝中α-磷酸甘油的生成受到限制，不能将更多的ffa酯化为甘油三酯，进一步促进更多的ffa氧化为乙酰辅酶a和乙酰乙酰辅酶a，两者经过缩合，再分解成乙酰乙酸。乙酰乙酸加氢还原成β-羟丁酸或脱羧生成丙酮，这样就使得血液中的酮体增高。


技术实现要素：

3.为了解决背景技术中存在的技术问题，本发明提供一种奶牛血液的脂质组学标志物 (ffa18:1、ffa16:0，ffa)，以及它们在奶牛酮病敏感度的检测和酮病奶牛和/或健康者相区分中的应用。实验数据表明脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa均与奶牛酮病呈显著相关。
4.本发明的奶牛血液的脂质组学标志在奶牛酮病敏感度检测中的应用，奶牛血液的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0和ffa均与奶牛酮病密切相关；通过测定奶牛血清中脂质的种类和各种脂质的定量分析，利用统计学分析得出奶牛血液的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0， ffa与奶牛酮病呈显著相关性，p＜0.05。
5.作为本发明的进一步改进，当阈值ffa18:1≥0.0000734157835时奶牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％；当阈值ffa16:0≥0.0003246754889时奶牛患有酮病的敏感度为 100％，特异性为80％，当阈值ffa≥0.0009325251628时奶牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％。
6.作为本发明的进一步改进，所述的奶牛血清中脂质种类的的测定方法，如下：
7.步骤1，脂质提取：收集目标奶牛的血液，使用改进的bligh/dyer提取方法
1.，提取奶牛血液中的总脂质；
8.步骤2，种类分析：将步骤(1)中提取出的总脂质复融在同位素混标(如同位素内标 tag(14:0)3-d5、tag(16:0)3-d5、ag(18:0)3-d5、dag(17:0/17:0)-d5、dag(18:1/18:1)-d5) 里，使用液质联用仪exionuplc-qtrap6500plus(sciex)，以电喷雾电离(esi)模式进行脂质种类分析；
9.步骤3，脂质分离：利用飞诺美lunasilica3μm(内径150x2.0mm)色谱柱，将步骤(1) 中提取的总脂质进行分离；
10.步骤4，脂质分析：建立质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)，将步骤 (3)分离出的各种脂质进行鉴定和定量分析；
11.步骤5，脂质定量：通过加入的内标，对步骤(3)分离出的各种脂质进行定量分析；
12.步骤6，xx分析：利用反相高效液相色谱-质谱法的修改版本，对进行步骤(3)分离出的各种脂质分析
1.。
13.步骤7，内标定量：利用游离的胆固醇和甾醇类以及相应的酯用串联质谱，以及大气压化学电离模式(apci)分析了游离胆固醇和胆固醇酯，使用d6-cho、d6-ce作为内标定量
[1-4]
。最终获得各种脂质的定量分析数据。
[0014]
作为本发明的进一步改进，步骤1中，对5头健康奶牛和5头酮病奶牛收集到的血清， 1只/组，用改进的bligh/dyer提取方法，提取两次，从样品中提取脂质。
[0015]
作为本发明的进一步改进，步骤2中，所述的电喷雾电离(esi)模式进行的所有分析条件如下：气帘气＝20、离子喷雾电压＝5500v、温度＝400℃、雾化气压＝35pa、辅助气压＝35pa。
[0016]
作为本发明的进一步改进，步骤3中，分离条件如下：流动相a(氯仿：甲醇：氨水 89.5：10：0.5)，b(氯仿：甲醇：氨水：水55：39：0.5：5.5)；流动相a梯度从95％开始保持5min，然后在7min内线性降低至60％并保持4min，然后将流动相a进一步降至30％并保持15min；最后用初始梯度保持5min。
[0017]
作为本发明的进一步改进，步骤5中，内标包括：dmpc、dmpe、d31-ps，dmpg、 c14-lbpa、dic8-pi、c12-sm、cerd18：1/15：0-d7、c8-glucer、c8-galcer、d3-laccerd18： 1/16：0、gm3-d18：1/18：0-d3、gb3d18：1/17：0、c17-pa、c17：0-lpc、c17：0-lpa、 c17：1-lpi、c17：1-lps、c17：1-lpe、c17：1-lpg、d17：1-s1p、d17：1-sph、d31-16： 0、d8-20：4、d3-16：0-carnitine、d31-pc、d31-sm。均购于美国sigma。
[0018]
作为本发明的进一步改进，步骤6中，所述使用如先前报道的反相高效液相色谱-质谱法的修改版本
1.进行分析；方法如下：以氯仿：甲醇：0.1m乙酸铵(100：100：4)为流动相在飞诺美kinetex2.6μmc18柱(4.6
×
100mm)上等度洗脱中性脂，流速为160μl/min；基于中性丢失二级质谱技术，使用同位素内标tag(14：0)3-d5、tag(16：0)3-d5、tag(18： 0)3-d5、dag(17：0/17：0)-d5、dag(18：1/18：1)-d5。
[0019]
作为本发明的进一步改进，数据分析：所有数据应用ibmspss26.0软件进行统计分析，采用pearson直线相关性分析各指标与奶牛酮病相关性，p＜0.05为显著相关；采用roc曲线分析显著性指标的预警值，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7-0.9之间表示具有一般的预警作用，大于0.9可以作为金指标进行诊断。
[0020]
本发明具有的有益效果是：本发明基于上述背景通过对酮病奶牛与健康奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa含量进行皮尔逊相关性分析与roc曲线分析，确定当 ffa18:1≥0.0000734157835、ffa16:0≥0.0003246754889、ffa≥0.0009325251628时可诊断奶牛患有酮病，此方法可以非侵入性的群体监测牛群酮病发病情况，为疾病的防控提供有效的技术支持，有效减少牧场经济损失。
附图说明：
[0021]
图1是本发明血清脂质组学标志物ffa18:1roc曲线；
[0022]
图2是本发明血清脂质组学标志物ffa16:0roc曲线；
[0023]
图3是本发明血清脂质组学标志物ffa roc曲线；
[0024]
图4是本发明血清脂质组学标志物ffa18:1、ffa16:0、ffa roc联合曲线。
具体实施方式：
[0025]
奶牛血液的脂质组学标志物(ffa18:1、ffa16:0，ffa)，以及它们在奶牛酮病敏感度的检测和酮病奶牛和/或健康者相区分。其中奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa均与奶牛酮病密切相关，测定奶牛血清脂质种类，利用统计学分析得出奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa与奶牛酮病呈显著相关性，p＜0.05；当血清中的脂质 ffa18:1≥0.0000734157835、ffa16:0≥0.0003246754889、ffa≥0.0009325251628时可确定奶牛患有酮病。
[0026]
上述方案中实验动物数量，检测指标ffa18:1、ffa16:0，ffa均具有统计学意义。对实验数据进行person相关性分析发现奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa均呈显著相关性，p＜0.05。对实验数据进行roc曲线预警分析，奶牛血清中的脂质组学标志 ffa18:1、ffa16:0，ffa线下面积分别为0.88、0.92、0.88。表明奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa对奶牛酮病具有较好的预警作用。确定当 ffa18:1≥0.0000734157835时奶牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％，当 ffa16:0≥0.0003246754889时奶牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％，当 ffa≥0.0009325251628时奶牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％。
[0027]
本发明具有的有益效果是：本发明基于上述背景通过对酮病奶牛与健康奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa含量进行皮尔逊相关性分析与roc曲线分析，确定当 ffa18:1≥0.0000734157835、ffa16:0≥0.0003246754889、ffa≥0.0009325251628时可诊断奶牛患有酮病，此方法可以非侵入性的群体监测牛群酮病发病情况，为疾病的防控提供有效的技术支持，有效减少牧场经济损失。
[0028]
动物实验：于黑龙江省某采用自由卧栏、tmr(totalmixedrations全混合日粮)饲喂、年产奶量1.1-5吨的集约化奶牛养殖场选取2、3胎次产后7一14天新西兰荷斯坦奶牛10 头，依据血液酮体浓度将其分为酮病组(血液酮体浓度3mmol/l以上)及健康组(血液酮体浓度1.2mmol/l以下，无其他任何症状)，其中健康组5头，酮病组5头。采集实验奶牛血清，对采集血清进行脂质组学检测。
[0029]
测定奶牛血清脂质组学方法：
[0030]
步骤1，使用改进的bligh/dyer提取方法(两次提取)从收集到的奶牛血液中提取脂质[1]；对5头健康奶牛和5头酮病奶牛收集到的血清(1只/组)用改进的bligh/dyer提取方法(两次提取)从样品中提取脂质；
[0031]
步骤2，样品复融在同位素混标里，使用exionuplc-qtrap6500plus(sciex)液质联用仪，以电喷雾电离(esi)模式进行所有分析；所述的电喷雾电离(esi)模式进行的所有分析条件如下：气帘气＝20，离子喷雾电压＝5500v，温度＝400℃，雾化气压＝35，辅助气压＝35；
[0032]
步骤3，使用飞诺美lunasilica3μm(内径150x2.0mm)色谱柱，条件分离各种极性脂质；分离条件如下：流动相a(氯仿：甲醇：氨水89.5：10：0.5)，b(氯仿：甲醇：氨水：水55：39：0.5：5.5)。流动相a梯度从95％开始保持5min，然后在7min内线性降低至60％并保持4min，然后将流动相a进一步降至30％并保持15min。最后用初始梯度保持5min；
[0033]
步骤4，建立质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)用于各种脂质鉴定与定量分析[2-3]；
[0034]
步骤5，通过加入的内标进行脂质物质的定量；内标包括：dmpc、dmpe、d31-ps，dmpg、 c14-lbpa、dic8-pi、c12-sm、cerd18：1/15：0-d7、c8-glucer、c8-galcer、d3-laccerd18： 1/16：0、gm3-d18：1/18：0-d3、gb3d18：1/17：0、c17-pa、c17：0-lpc、c17：0-lpa、 c17：1-lpi、c17：1-lps、c17：1-lpe、c17：1-lpg、d17：1-s1p、d17：1-sph、d31-16： 0、d8-20：4、d3-16：0-carnitine、d31-pc、d31-sm。均购于美国sigma；
[0035]
步骤6，使用反相高效液相色谱质谱联用的修改版本进行分析[1]；所述使用如先前报道的反相高效液相色谱-质谱法的修改版本进行分析。方法如下：以氯仿：甲醇：0.1m乙酸铵(100：100：4)为流动相在飞诺美kinetex2.6μmc18柱(4.6
×
100mm)上等度洗脱中性脂，流速为160μl/min。基于中性丢失二级质谱技术，使用同位素内标tag(14：0)3-d5、 tag(16：0)3-d5、tag(18：0)3-d5、dag(17：0/17：0)-d5、dag(18：1/18：1)-d5；
[0036]
步骤7，游离的胆固醇和甾醇类以及相应的酯用串联质谱，大气压化学电离模式(apci) 进进分析，使用d6-cho、d6-ce作为内标定量[1-4]。
[0037]
其中，所有数据应用ibmspss26.0软件进行统计分析，采用pearson直线相关性分析各指标与奶牛酮病相关性，p＜0.05为显著相关；采用roc曲线分析显著性指标的预警值，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7-0.9之间表示具有一般的预警作用，大于 0.9可以作为金指标进行诊断。
[0038]
采用皮尔逊相关性分析各脂质标志与奶牛酮病的相关性，结果如表1所示，奶牛血清中的脂质组学标志：cerd18:1/17:0、tag48:1(18:0)、tag50:1(18:0)、tag50:0(18:0)、 tag52:1(18:1)、tag52:0(18:0)、tag54:2(18:2)、tag54:2(18:1)、tag54:2(18:0)、 tag54:1(18:0)、tag54:1(18:1)、tag54:0(18:0)、ce-14:0、ce-15:0、ce-16:2、ce-17:1、 ce-17:0、ce-20:3、ce-22:4、lpc18:3、lpc20:3、pc38:2p、pc38:1p、pc36:3、pc38:2、 pc38:1、smd18:1/15:1、smd18:1/20:1、lpi20:3呈显著负相关(p＜0.05)；ce-16:0，ce-18:3， ce-18:0，ce-20:2呈极显著负相关(p＜0.01)；18:0-carnitine、dag34:1(16:0/18:1)、 dag36:2(18:1/18:1)、bmp38:6(16:1_22:5)、ffa22:5、ffa18:2、ffa18:1、ffa17:0、ffa16:0、 pe38:5p、ffa呈显著相关(p＜0.05)。
[0039]
表1健康与酮病奶牛血液生化指标差异性比较
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049][0050]
利用roc曲线分析奶牛血清中的脂质组学标志ce15:0、ce16:0、ce 17:1等指标对奶牛酮病的预警作用，结果如表2所示，奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0， ffa曲线下面积分别为0.88、0.92、0.88。表明奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0， ffa对奶牛酮病具有较好的预警作用。
[0051]
表2.roc曲线下方区域
[0052][0053]
结合表二分析得出：曲线下方面积＞0.7的只有ffa18:1、ffa16:0，ffa
[0054]
表3通过roc曲线计算出约登指数得出敏感度
[0055]
[0056]
[0057][0058]
当ffa18:1≥0.0000734157835时牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％；
[0059]
当ffa16:0≥0.0003246754889时牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％；
[0060]
当ffa≥0.0009325251628时牛患有酮病的敏感度为100％，特异性为80％。
[0061]
表4奶牛血清中的脂质组学标志ffa18:1、ffa16:0，ffa诊断参数
[0062]
指标阈值敏感度特异度曲线下面积ffa18:10.000073415784100800.88ffa16:00.000324675489100800.92ffa0.000932525163100800.88
[0063]
文中提及的参考文献如下：
[0064]
[1]lam,s.m.,zhang,c.,wang,z.etal.amulti-omicsinvestigationofthecompositionandfunctionofextracellularvesiclesalongthetemporaltrajectoryofcovid-19.naturemetabolism(2021).https://doi.org/10.1038/s42255-021-00425-4
[0065]
[2]luj#,lamsm#,wanq,shil,huoy,chenl,tangx,lib,wux,pengk,lim,wangs,xuy,xum,biy,ningg,shuig*,wangw*.high-coveragelipidomicsrevealsnovelserumlipidpredictorsandlipidpathwaydysregulationantecedenttotype2diabetesonsetinnormoglycemicchineseadults.diabetescare,2019nov；42(11):2117-2126.doi:10.2337/dc19-0100.epub2019aug27.
[0066]
[3]lamsm,wangr,miaoh,lib,shuig.anintegratedmethodfordirectinterrogationofsphingolipidhomeostasisintheheartandbraintissuesofmicethroughpostnataldevelopmentuptoreproductivesenescence.analyticachimicaacta.2018dec11；1037:152-158.doi:10.1016/j.aca.2018.01.015.epub2018feb3.
[0067]
[4]lamsm,wangz,lij,huangx,shuig.sequestrationofpolyunsaturatedfattyacidsinmembranephospholipidsofcaenorhabditiselegansdauerlarva
attenuates eicosanoid biosynthesis for prolonged survival.redox biology.2017 aug；12:967-977.doi:10.1016/j.redox.2017.05.002. epub 2017 may 4。