一种基于离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法

本发明涉及外泌体检测，尤其涉及一种于离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法。

背景技术：

1、乳腺癌(breast cancer,bc)作为全球第一大癌，严重危害女性健康。提高bc的生存率以及改善其预后的关键在于如何实现bc的早发现以及早治疗。现阶段临床上基于影像学检查等方法侵入性强且准确率不高，液体活检标志物具有无创、简便快捷并且能持续监测疾病变化等优点，可与临床方法相结合。近年来，外泌体作为新型的液体活检标志物已经成为癌症诊断的重要生物标志物。elisa和western blot是外泌体检测的标准方法，但样本量需求大且步骤繁琐。因此需要开发新的平台来实现外泌体分离和检测的一体化。目前报道了大量基于免疫荧光和免疫亲和的微流控芯片用于循环外泌体富集、定量和癌症患者血清蛋白分析。然而，如何快速方便的从外周血中分离血清一直是研究人员关注的重点。圆盘式微流控芯片，已经成为癌症分析的潜在工具，主要有离心、过滤、电泳以及重力沉降等这些分离血液的方法，广泛应用于生化检测、免疫分析、核酸扩增、环境监测、细胞分选和食品安全等领域，但在乳腺癌的早期诊断中还未实现应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法。

2、实现本发明目的的技术方案是提供一种基于离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法，该离心圆盘芯片包括单元结构，所述单元结构为依次连接的分离腔、倾析腔、第一虹吸管道、三角柱阵列区、第二虹吸管道、显色区，所述第一虹吸管道上设置有虹吸阀。

3、进一步的，还包括3个进样口，所述进样口分别位于分离腔上端、倾析腔上端以及第二虹吸管道上。

4、进一步的，所述显色区尾部设置有额外的通道排气孔。

5、进一步的，所述三角柱阵列区设置了梯度间隙为0.2mm，0.1mm和0.05mm。

6、进一步的，所述离心圆盘芯片共有4个两两对称分布的单元结构。

7、进一步的，所述离心圆盘芯片应用于血清的快速分离，与智能手机联合实现实时检测。

8、该方法包括以下步骤：

9、s1、将一定量的样本加入分离腔上端的进样口；

10、s2、向倾析腔上端的进样口中加入cd63磁珠，在第一转速下持续一定时间即可实现了血细胞和血清的快速有效分离；

11、s3、当转速超过毛细阀的阈值(961rpm)时，样品将突破毛细阀进入第一虹吸管道；

12、s4、第二次启动离心机，在第二转速下，样品沿第一虹吸管道流至三角柱阵列区的入口，该入口相当于一个毛细阀，此时液体停在这里；

13、s5、第三次启动离心机，在第三转速下，倾析腔内样品通过三角柱阵列区三角柱梯度的间隙直至底部显色区；

14、s6、显色区内加入显色剂与样品中外泌体进行免疫亲和，形成显色反应，实现外泌体的可视化分析检测。

15、进一步的，s2中所述第一转速为2000rpm，所述的一定时间为5min；s4中的述第二转速为低速旋转500rpm；s5中的述第三转速为高速旋转3000rpm。

16、进一步的，所述的免疫亲和为利用外泌体多重表面蛋白标记物，结合hrp催化四甲基联苯胺(tmb)的显色反应。

17、进一步的，所述的多重表面蛋白标记物为cea+ca125+egfr多个标记物。

18、采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

19、(1)本发明利用流体在离心力作用下设计了分离-倾析，快速实现了血细胞以及血清的分离。

20、(2)本发明利用液体与亲水表面之间的毛细力设计了虹吸阀，通过转速的转换实现血清的自动进样。

21、(3)本发明选择操作简便的比色分析法对血样进行分析，结合智能手机实时检测血清中外泌体，自动化程度高非常适用于临床应用，利用这个比色平台，实现了对bc的诊断和监测。

22、(4)本发明作为新一代血液微分离芯片的雏形，每个单元结构具有四个功能区域，分别是分离-倾析结构、虹吸阀、三角形阵列区和显色区，通过各个功能区域的有机结合，有效地实现小样本量的血液快速分离与检测。

23、(5)本发明离心圆盘芯片简便快捷，无需进行繁琐的外泌体预分离，通过程序化的离心步骤即可实现血样的分离与检测，一体化的检测方案为乳腺癌的诊断提供了一种潜在的检测平台。

24、(6)本发明与商用的cea小鼠elisa试剂盒对比，离心圆盘芯片在检测乳腺癌疾病进程方面的性能优于商业elisa，使得检出时间提前到了第20天，实现了乳腺癌的早期诊断。

技术特征：

1.一种离心圆盘芯片，其特征在于：包括单元结构，所述单元结构为依次连接的分离腔(1)、倾析腔(2)、第一虹吸管道(3)、三角柱阵列区(4)、第二虹吸管道(5)、显色区(6)，所述第一虹吸管道(3)上设置有虹吸阀(9)。

2.根据权利要求1所述的离心圆盘芯片，其特征在于：还包括3个进样口(7)，所述进样口(7)分别位于分离腔(1)上端、倾析腔(2)上端以及第二虹吸管道(5)上。

3.根据权利要求1所述的离心圆盘芯片，其特征在于：所述显色区(6)尾部设置有额外的通道排气孔(8)。

4.根据权利要求1所述的离心圆盘芯片，其特征在于：所述三角柱阵列区(4)设置了梯度间隙为0.2mm，0.1mm和0.05mm。

5.根据权利要求1所述的离心圆盘芯片，其特征在于：所述离心圆盘芯片共有4个两两对称分布的单元结构。

6.根据权利要求1所述的离心圆盘芯片，其特征在于：所述离心圆盘芯片应用于血清的快速分离，与智能手机联合实现实时检测。

7.一种基于权利要求1所述离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，s2中所述第一转速为2000rpm，所述的一定时间为5min；s4中的述第二转速为低速旋转500rpm；s5中的述第三转速为高速旋转3000rpm。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的免疫亲和为利用外泌体多重表面蛋白标记物，结合hrp催化四甲基联苯胺(tmb)的显色反应。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的多重表面蛋白标记物为cea+ca125+egfr多个标记物。

技术总结
本发明涉及一种基于离心圆盘芯片检测乳腺癌外泌体的方法，作为新一代血液微分离芯片的雏形，每个单元结构具有四个功能区域，分别是分离‑倾析结构、虹吸阀、三角形阵列区和显色区，通过各个功能区域的有机结合，有效地实现小样本量的血液快速分离与检测。离心圆盘芯片简便快捷，无需进行繁琐的外泌体预分离，通过程序化的离心步骤即可实现血样的分离与检测，一体化的检测方案为乳腺癌的诊断提供了一种潜在的检测平台。

技术研发人员：余绍宁,王妍蔺,高文静,沈昊
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12