一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中喹诺酮药物残留的方法与流程

10 min，离心，取上清液置于506 nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中喹诺酮含量。
7.所述cu2o/ce-tcpp纳米酶制备如下： cu2o的制备：在2mol/l 10
ꢀ‑
15 ml的naoh溶液中加入0.01 mol/l 100-120 ml cucl2，5-10g聚乙烯基吡咯烷酮（pvp），室温搅拌30-40 min，然后加入0.6mol/l 5
ꢀ‑
10 ml抗坏血酸，在55℃水浴中搅拌5-6 h，用去离子水洗涤2-3次，真空干燥，即得。
8.②ꢀ
cu2o/ce-tcpp的制备：取上述制备的cu2o颗粒30-35mg，加入0.1 mol/l 20-25 ml ce(no3)
3 的dmf溶液，超声处理20-30 min，加入到0.02gtcpp溶解在dmf溶液10ml中，120 ℃搅拌6-8 h，离心，用乙醇和去离子水交替洗涤2-3次，真空干燥，即得。
9.所述的样品测定液制备如下： 动物组织样品：称取均质试样1.0g（精确至0.1g），置于10ml离心管中，加入5ml 0.1mol/l edta-mcllvaine缓冲溶液，涡旋混合1min，超声提取10-15min，离心，提取3次，合并上清液，向上清液中少量2-3次加入20ml正庚烷，振荡，使脂溶性物质溶于正庚烷，弃去上层烷层除脂。将下层清液减压挥干溶剂，之后用水溶至容量瓶中，得样品液。
[0010] 牛奶和鸡蛋样品：称取1.00ml均质试样，加入1:4 (v/v) 的乙酸盐缓冲液-乙腈混合溶液10.00ml，涡旋混合1min，离心，除去蛋白质。向上清液中少量2-3次加入20ml正庚烷，振荡，使脂溶性物质溶于正庚烷，弃去上层烷层除脂。将下层清液减压挥干溶剂，之后用水溶至容量瓶中，得样品液。
[0011]
100
µ
g/ml cu2o/ce-tcpp纳米酶添加量为50~100
µ
l，1mg/ml 2,4-dp添加量为100-150
ꢀµ
l，1mg/ml 4-ap添加量为100-150
ꢀµ
l，200 μg/ml 亚硝酸盐溶液添加量为50-100
ꢀµ
l，离心条件为离心时间5-10 min，离心速率1000-3000 r/min。
[0012]
本发明的优点在于：1、本发明利用亚硝酸盐加速cu2o/ce-tcpp的拟漆酶氧化4-氨基安替比林（4-ap）和邻氯酚（2,4-dp）偶联显色氧化反应，基于喹诺酮类药对氧化反应的抑制作用，其浓度与吸光度降低呈线性关系，建立高灵敏、选择性强喹诺酮类药检测新方法，方法具有灵敏度高、操作简便、特异性强特点。
[0013]
2、利用cu2o纳米八面体及铈离子制备tcpp基mofs二维cu2o/ce-tcpp纳米片，从cu2o中释放出来的cu
+
会被溶解氧及ce
4+
氧化成cu
2+
及ce
3+
，形成了类漆酶活性催化循环，表现出类漆酶活性。
[0014]
3、利用no
2-对cu2o/ce-tcpp纳米酶中ce
4+
/ce
3+
及 cu
+
/cu
2+
化合价的调节，加速cu2o/ce-tcpp的拟漆酶的活性，而喹诺酮与铜离子及铈离子形成配合物，抑制了漆酶的活性，提高检测方法的特异性。
附图说明
[0015]
图1为合成cu2o/ce-tcpp的sem图；图2为实施例1中亚硝酸盐对cu2o/ce-tcpp的拟漆酶氧化4-ap和2,4-dp偶联显色氧化反应增敏、氧氟沙星抑制的紫外-可见吸收光谱；图3为氧氟沙星对氧化体系梯度抑制的紫外-可见吸收光谱；
图4为氧氟沙星的线性方程；图5为共存喹诺酮对氧氟沙星的影响。
[0016]
具体实施方式
[0017]
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0018]
实施例1：鸡肉样品中喹诺酮的测定1、cu2o的制备：在2mol/l 10 ml的naoh溶液中加入0.01 mol/l 100ml cucl2，5g聚乙烯基吡咯烷酮（pvp），室温搅拌30min，然后加入0.6mol/l 5ml抗坏血酸，在55℃水浴中搅拌5h，用去离子水洗涤2-3次，真空干燥，即得。
[0019]
2、cu2o/ce-tcpp的制备：取上述制备的cu2o颗粒30mg，加入0.1 mol/l 20ml ce(no3)
3 dmf溶液，超声处理20min，加入到0.02gtcpp溶解在dmf溶液10ml中，120 ℃搅拌6h，离心，用乙醇和去离子水交替洗涤2-3次，真空干燥，即得。其sem如图1，从中可以看出，合成的纳米材料具有八面体结构。
[0020]
3、氧氟沙星工作曲线制作：在5 ml具塞比色管中加入50
ꢀµ
l cu2o/ce-tcpp纳米酶，1mg/ml 2,4-dp 100
ꢀµ
l，1mg/ml4-ap 100
ꢀµ
l，200 μg/ml 亚硝酸盐溶液50
µ
l，0.66-100μg/l氧氟沙星标准溶液，用mes 缓冲溶液（30 mm, ph = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度a，以氧氟沙星浓度为横坐标，a为纵坐标，绘制标准曲线，见图2-4，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。由图2可以看出，no
2-明显增加了体系的吸光度，而氧氟沙星明显降低了体系的吸光度。
[0021]
4、方法特异性考察：图4是氧氟沙星浓度为10μg/l，同浓度的左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、洛美沙星、加替沙星、恩诺沙星、培氟沙星、依诺沙星、吡呱酸、奥索利酸、氟甲喹、西诺沙星、单诺沙星对氧氟沙星的影响，分别加入 cu2o/ce-tcpp、2,4-dp及4-ap，左氧氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星也有相似作用，其它共存物质几乎没有作用，方法用于以氧氟沙星为主要代表的五种喹诺酮总含量测定。
[0022]
5、鸡肉样品中喹诺酮的测定（1）称取均质试样1.0g（精确至0.1g），置于10ml离心管中，加入5ml 0.1mol/l edta-mcllvaine缓冲溶液，涡旋混合1min，超声提取10-15min，离心，提取3次，合并上清液，向上清液中少量2-3次加入20ml正庚烷，振荡，使脂溶性物质溶于正庚烷，弃去上层烷层除脂。将下层清液减压挥干溶剂，之后用水溶至容量瓶中，得样品液。
[0023]
（2）样品测定：在5 ml具塞比色管中加入50-100
ꢀµ
l cu2o/ce-tcpp纳米酶，1mg/ml 2,4-dp 100
ꢀµ
l，1mg/ml4-ap 100
ꢀµ
l，200 μg/ml 亚硝酸盐溶液50
ꢀµ
l，步骤（1）得到样品液，用mes 缓冲溶液（30 mm, ph = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度a，代入步骤（1）回归方程，样品喹诺酮未检出。
[0024]
（3）回收率与精密度实验：在鸡肉样品中分别添加3个不同浓度的氧氟沙星标准溶液。每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差rsd，结果见表2。测得氧氟沙星的加标回收率在96.3％～102.1％，rsd在1.12％～3.20％，本方法有好的的准确性和精密度。
[0025]
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围表2 样品加标回收率及rsd（n = 3）。
[0026]
实施例2：牛奶样品中喹诺酮的测定1、cu2o的制备：同实施例1；2、cu2o/ce-tcpp的制备：同实施例1；3、氧氟沙星工作曲线制作：同实施例1；4、方法特异性考察：同实施例1；5、牛奶样品中喹诺酮的测定（1）称取1.00ml均质试样，加入1:4 (v/v) 的乙酸盐缓冲液-乙腈混合溶液10.00ml，涡旋混合1min，离心，除去蛋白质。向上清液中少量2-3次加入20ml正庚烷，振荡，使脂溶性物质溶于正庚烷，弃去上层烷层除脂。将下层清液减压挥干溶剂，之后用水溶至容量瓶中，得样品液。
[0027]
（2）样品测定：在5 ml具塞比色管中加入50
µ
l cu2o-ce-tcpp纳米酶，1mg/ml 2,4
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2,4-dp 100
ꢀµ
l，1mg/ml 4-ap 100
ꢀµ
l，200 μg/ml 亚硝酸盐溶液50
ꢀµ
l，步骤（1）得到样品液，用mes 缓冲溶液（30 mm, ph = 6.2）稀释至刻度，摇匀，静置5-10 min，离心，取上清液，以506 nm波长处，测定吸光度a，代入步骤（1）回归方程，样品喹诺酮为3.5
µ
g/kg。
[0028]
实施例3：鸡蛋样品中喹诺酮的测定1、cu2o的制备：同实施例1；2、cu2o/ce-tcpp的制备：同实施例1；3、氧氟沙星工作曲线制作：同实施例1；4、方法特异性考察：同实施例1；5、牛奶样品中喹诺酮的测定：同实施例2，样品喹诺酮未检出。
[0029]
将实施例1-3用本发明方法与国家标准gb/t 20366-2006 和 gb/t 21312-2007 进行比对，结果见表3。从结果可以看出，两种方法结果一致。
[0030]
表3本法与gb方法测定结果（μg/kg）
本发明建立的喹诺酮测定法具有处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。