一种基于噬菌体修饰磁性类过氧化物酶的金黄色葡萄球菌比色分析方法

本发明涉及一种基于噬菌体修饰磁性类过氧化物酶的金黄色葡萄球菌比色分析方法，属于生物。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌是人类和动物共生菌群的一部分，可导致从轻微的皮肤感染到危及生命的疾病，如肺炎、中毒性休克综合征和败血症。mdr和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)因其表型可塑性和适应性，在临床和牲畜相关的环境和食物链中经常被检测到。因此，准确、快速地检测和识别金黄色葡萄球菌不仅在公共卫生方面，而且在医疗诊断、食品安全、环境监测方面都具有特别重要的意义。

2、快速、有效、准确地诊断金黄色葡萄球菌对于快速治疗感染患者、防止感染传播和减少耐药菌株的形成具有重要意义。以培养为基础的传统检测金黄色葡萄球菌的方法，虽然便宜、简单并可以获得定性和定量的结果，但其费力、耗时、操作复杂且很难满足实际需求。近年来，许多非培养技术检测病原菌的方法快速发展并应用，例如，分子生物学方法(如dna芯片)和免疫学方法(如酶联免疫吸附测定法)。尽管这些方法检测金黄色葡萄球菌具有特异性好、灵敏度高等优点，但却需要昂贵的设备和训练有素的实验室分析人员，以及复杂的样品制备过程。因此，制备出一种能克服干扰且快速、简便、特异、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对以上背景技术中的技术问题，提供一种基于噬菌体修饰磁性类过氧化物酶的金黄色葡萄球菌比色分析方法。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测金黄色葡萄球菌的噬菌体修饰磁性类过氧化物酶，包括金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzualpha、聚乙烯亚胺和fe3o4，金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzualpha以金黄色葡萄球菌atcc29213为宿主菌，通过静电作用，利用聚乙烯亚胺将金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzualpha头部固定在fe3o4表面，金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzualpha尾部裸露在外，能够特异性捕获金黄色葡萄球菌。

3、所述金黄色葡萄球菌噬菌体sapyzualpha的保藏编号为cctcc no：m2022023(制备方法参考中国专利文献cn 114807058 a记载的方法)。

4、一种噬菌体修饰磁性类过氧化物酶的制备方法，所述方法如下：

5、步骤s1：噬菌体的分离与纯化，得到噬菌体悬液；

6、步骤s2：制备pei@fe3o4溶液；

7、步骤s3：取步骤s1中得到的噬菌体悬液与步骤s2中得到的pei@fe3o4溶液进行混合，孵化，得到sapyzu15@pei@fe3o4溶液。

8、优选的，所述步骤s1具体如下：步骤s1-1：采集扬州市某菜市场及周边污水，取50ml污水，离心机中8000rpm离心10min，依次用0.45μm和0.22μm无菌滤膜过滤杂质，取上清液；

9、步骤s1-2：取步骤s1-1中的上清液3ml与等量的2×lb液体培养基混合，并加入100μl金黄色葡萄球菌atcc 29213菌悬液，37℃下过夜培养，离心过滤得到粗噬菌体裂解液；

10、步骤s1-3：向含有5ml的lb半固体培养基的无菌离心管中加入步骤s1-2中的裂解液和金黄色葡萄球菌atcc 29213菌悬液各100μl，立即倾倒在底层lb固体培养基上，制成双层平板，在37℃下过夜培养；

11、步骤s1-4：挑取单个步骤s1-3中双层平板的噬菌体空斑于含有100μl金黄色葡萄球菌atcc 29213菌悬液的lb试管中，置于37℃、125rpm条件下培养，次日取出，离心过滤得到噬菌体裂解液；

12、步骤s1-4：将步骤s1-4中的裂解液按照步骤s1-3和步骤s1-4中的方法交替进行，直至双层平板上形成的明亮清澈、大小均一的噬菌体空斑，制成噬菌体悬液。

13、优选的，所述步骤s2具体如下：

14、步骤s2-1：将5.63g无水氯化铁和5.0g七水硫酸亚铁分散在400ml去离子水中，超声溶解10min；

15、步骤s2-2：步骤s2-1得到的混合物在85℃条件下，通入氮气并搅拌30min；

16、步骤s2-3：向步骤s2-2中加入100ml氢氧化铵、0.306g柠檬酸三钠和10.4g聚乙烯亚胺，搅拌30min直至完全溶解；

17、步骤s2-4：将步骤s2-3中得到溶液，利用磁铁进行磁分离并收集合成的fe3o4，用乙醇和去离子水交替洗涤5-8次，制成pei@fe3o4溶液。

18、优选的，步骤s2-3中所述聚乙烯亚胺的分子量为10000。

19、优选的，所述步骤s3具体如下：按体积比，分别取pei@fe3o4溶液2份、噬菌体悬液1份进行混合，涡旋30s，在37℃、125rpm条件下培养6h，制成sapyzu15@pei@fe3o4溶液。

20、优选的，所述噬菌体悬液的浓度为109pfu/ml。

21、噬菌体修饰磁性类过氧化物酶检测金黄色葡萄球菌的方法，所述方法如下：

22、1)将hac-naac缓冲液分别置于实验组的离心管中、空白对照组的离心管中，再分别加入sapyzu15@pei@fe3o4溶液；

23、2)向1)中实验组的离心管中加入待测样品，等待溶液中的细菌和噬菌体充分吸附后，依次加入h2o2溶液和tmb溶液，等待显色反应，肉眼观察颜色或采用紫外分光光度计测吸收光。

24、优选的，所述的tmb溶液浓度为0.1-50mm，h2o2溶液浓度为10-1000mm，hac-naac缓冲液ph范围为3.0-9.0。

25、优选的，所述的tmb溶液浓度为5mm，h2o2溶液浓度为100mm，hac-naac缓冲液ph为4.0，吸附时间为25min，显色反应时间为20min。

26、其中，作为优选，所述的金黄色葡萄球菌为标准菌株金黄色葡萄球菌atcc29213，浓度为109cfu/ml；

27、其中，作为优选，sapyzu15@fe3o4溶液中，铁的含量为1.68mg/g；

28、本发明具有以下有益效果：本发明提供的sapyzu15@fe3o4溶液中噬菌体的活性较好；本发明提供了一种基于噬菌体修饰磁性类过氧化物酶的金黄色葡萄球菌比色分析方法，将噬菌体sapyzualpha定向固定在fe3o4纳米粒子表面制备噬菌体修饰磁性类过氧化物酶sapyzu15@fe3o4。将待测液与sapyzu15@fe3o4溶液在缓冲液中充分混合，再加入100μl的h2o2和100μl tmb溶液，检测溶液颜色，计算金黄色葡萄球菌浓度。本发明所述噬菌体修饰磁性类过氧化物酶能够快速比色检测样品的金黄色葡萄球菌，最低检测浓度为3×102cfu/ml。此外，本发明所述方法能够避免大肠杆菌、沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌以及它们混合物的干扰，对金黄色葡萄球菌具有很强特异性强。因此，本发明提出的利用噬菌体修饰磁性类过氧化物酶比色检测金黄色葡萄球菌具有检测速度快、特异性高、灵敏性高、设备依赖度低、操作简单、成本低廉等优点，适合食品样本中金黄色葡萄球菌的可视化快速检测要求。