鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法。

背景技术：

1、近年来，驼乳、水牛乳、牦牛乳、马乳和山羊乳等特种乳因具有独特营养价值而广受消费者喜爱。联合国粮农组织(food and agriculture organization，fao)的数据显示，截止到2020年，牛乳仍占全球生鲜乳生产量排名的榜首，水牛奶、山羊奶、绵羊奶和骆驼奶等特种乳产量相对较低，其中骆驼乳产量远低于其他动物乳。驼乳营养丰富，被誉为“沙漠白金”，不含有过敏原β-乳球蛋白，适合过敏症患者，且成分与人乳相似，可以作为人乳替代品。但由于骆驼乳产量低，乳供应量明显受季节性波动的影响，且奶源质量难以控制，骆驼乳及其制品成为蓄意掺假的目标。往高价值的骆驼乳及其制品中掺入低值的牛、羊等动物乳是最常见的掺假行为，不仅造成消费者的经济损失，还可能危害消费者的身体健康。

2、食品质量和安全的评估是保证消费者免受健康风险和非法经济行为的主要挑战。人们对骆驼奶的追捧使得骆驼奶及奶粉造假事件频发，屡禁不止的一部分原因是缺少可靠、便捷的鉴定技术支持。奶粉经高温灭菌、喷雾干燥等制作工艺，破坏了本身的特性，为动物乳源性成分的来源鉴别增加了困难。目前国家还没有有效鉴别骆驼乳源性成分的方法，只能靠从生产源头进行控制，导致了许多不法企业钻空子。

3、目前，基于dna的聚合酶链式反应(pcr)方法和基于蛋白质组学的质谱(ms)方法在骆驼奶与其他物种奶鉴定方面应用广泛。此外，二维凝胶电泳(2-de)与核磁共振(nmr)方法也有应用。然而，由于多重引物设计要求高，pcr方法无法实现8物种同时检测；2-de方法分辨率较低，需要结合ms方法进行验证，上述两种方法均增加了实验的复杂性；而nmr方法无法靶向目标物，同时需要额外的数据解析。基于蛋白质组学的质谱mrm技术克服了以上问题，前处理过程简单，质谱仪可以根据不同物种本身蛋白质氨基酸序列的细微差异识别动物乳来源，同时高效、准确地靶向目标肽。因此，迫切需要一种高效准确鉴定骆驼奶及奶粉真伪的质谱检测方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供的鉴别骆驼奶和其他7种动物奶的质谱检测方法，能高效、准确地靶向目标肽，对未知乳品进行鉴别，特别是骆驼乳。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了多肽x，具有：

4、(i)、如seq id no:x所示的氨基酸序列；或

5、(ii)、如(i)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(i)的相同或相似；或

6、(iii)、与如(i)或(ii)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；

7、其中，x选自2～5、7～15、17～25中的任一整数；

8、所述多个为2个至3个。

9、本发明还提供了多肽组合y，y选自1～7中的任一整数；

10、其中，多肽x具有：

11、(iv)、如seq id no:x所示的氨基酸序列；或

12、(v)、如(iv)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(iv)的相同或相似；或

13、(vi)、与如(iv)或(v)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；

14、其中x选自1～25中的任一整数；

15、所述多个为2个至3个；

16、所述多肽组合1包括所述多肽1、所述多肽2、所述多肽3或所述多肽4中的两者或以上；

17、所述多肽组合2包括所述多肽5、所述多肽6或所述多肽7中的两者或以上；

18、所述多肽组合3包括所述多肽8、所述多肽9或所述多肽10中的两者或以上；

19、所述多肽组合4包括所述多肽11和所述多肽12；

20、所述多肽组合5包括所述多肽13和所述多肽14；

21、所述多肽组合6包括所述多肽16、所述多肽17或所述多肽18的两者或以上；

22、所述多肽组合7包括所述多肽19、所述多肽20、所述多肽21、所述多肽22、所述多肽23、所述多肽24或所述多肽25的两者或以上。

23、本发明还提供了上述多肽x的应用，包括：

24、当x为2、3或4时，上述多肽x在如下方面的应用：

25、(1)、检测骆驼乳源性成分；和/或

26、(2)、鉴别骆驼乳；和/或

27、(3)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

28、(4)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；

29、当x为5、6或7时，上述多肽x在如下方面的应用：

30、(5)、检测牛乳源性成分；和/或

31、(6)、鉴别牛乳；和/或

32、(7)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

33、(8)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；

34、当x为8、9或10时，上述多肽x在如下方面的应用：

35、(9)、检测水牛乳源性成分；和/或

36、(10)、鉴别水牛乳；和/或

37、(11)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

38、(12)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；

39、当x为11或12时，上述多肽x在如下方面的应用：

40、(13)、检测牦牛乳源性成分；和/或

41、(14)、鉴别牦牛乳；和/或

42、(15)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

43、(16)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；

44、当x为13或14时，上述多肽x在如下方面的应用：

45、(17)、检测山羊乳源性成分；和/或

46、(18)、鉴别山羊乳；和/或

47、(19)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

48、(20)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；

49、当x为15时，上述多肽x在如下方面的应用：

50、(21)、检测绵羊乳源性成分；和/或

51、(22)、鉴别绵羊乳；和/或

52、(23)、制备检测绵羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

53、(24)、制备鉴别绵羊乳的试剂、试剂盒或装置；

54、当x为17或18时，上述多肽x在如下方面的应用：

55、(25)、检测驴乳源性成分；和/或

56、(26)、鉴别驴乳；和/或

57、(27)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

58、(28)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；

59、当x为19、20、21、22、23、24或25时，上述多肽x在如下方面的应用：

60、(29)、检测马乳源性成分；和/或

61、(30)、鉴别马乳；和/或

62、(31)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

63、(32)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。

64、本发明还提供了上述多肽组合y的应用，包括：

65、当y为1时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

66、(33)、检测骆驼乳源性成分；和/或

67、(34)、鉴别骆驼乳；和/或

68、(35)、制备检测骆驼乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

69、(36)、制备鉴别骆驼乳的试剂、试剂盒或装置；

70、当y为2时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

71、(37)、检测牛乳源性成分；和/或

72、(38)、鉴别牛乳；和/或

73、(39)、制备检测牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

74、(40)、制备鉴别牛乳的试剂、试剂盒或装置；

75、当y为3时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

76、(41)、检测水牛乳源性成分；和/或

77、(42)、鉴别水牛乳；和/或

78、(43)、制备检测水牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

79、(44)、制备鉴别水牛乳的试剂、试剂盒或装置；

80、当y为4时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

81、(45)、检测牦牛乳源性成分；和/或

82、(46)、鉴别牦牛乳；和/或

83、(47)、制备检测牦牛乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

84、(48)、制备鉴别牦牛乳的试剂、试剂盒或装置；

85、当y为5时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

86、(49)、检测山羊乳源性成分；和/或

87、(50)、鉴别山羊乳；和/或

88、(51)、制备检测山羊乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

89、(52)、制备鉴别山羊乳的试剂、试剂盒或装置；

90、当y为6时，所述多肽组合y在如下方面的应用：

91、(53)、检测驴乳源性成分；和/或

92、(54)、鉴别驴乳；和/或

93、(55)、制备检测驴乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

94、(56)、制备鉴别驴乳的试剂、试剂盒或装置；

95、当y为7时，所述多肽组合y如下方面的应用：

96、(57)、检测马乳源性成分；和/或

97、(58)、鉴别马乳；和/或

98、(59)、制备检测马乳源性成分的试剂、试剂盒或装置；和/或

99、(60)、制备鉴别马乳的试剂、试剂盒或装置。

100、在本发明的一些具体的实施方案中，上述应用中所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽x的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽x的质谱峰，获得检测结果；

101、所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽x的质谱检测谱图和其他动物乳特征肽段的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽x的质谱峰和其他动物乳特征肽段的质谱峰，获得鉴别结果。

102、在本发明的一些具体的实施方案中，上述应用中所述检测包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽组合y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合y的质谱峰，获得检测结果；

103、所述鉴别包括对经质谱前处理后的待测样品进行质谱检测，与上述多肽组合y的质谱检测谱图比较，判断所述待测样品是否含有所述多肽组合y的质谱峰，获得检测结果。

104、本发明还提供了试剂、试剂盒和/或装置，包括如下项，以及可接受的辅料、助剂或部件：

105、(a)、上述多肽x；或

106、(b)、上述多肽组合y；

107、其中，x选自1～25中的任一整数；

108、y选自1～7中的任一整数。

109、在本发明的一些具体的实施方案中，上述试剂、试剂盒和/或装置中，所述多肽x中的x选自2～5、7～15、17～25中的任一整数。

110、本发明还提供了鉴别乳品的方法，包括如下步骤：

111、步骤(i)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；

112、步骤(ii)：通过质谱法检测上述多肽组合y和步骤(i)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图进行判断，获得鉴别结果；

113、其中，y选自1～7中的任一整数；

114、所述判断包括：

115、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1的质谱峰，且不出现所述多肽组合2至7的质谱峰，则所述待测样品为骆驼乳；或

116、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合2的质谱峰，且不出现所述多肽组合1和多肽组合3至7的质谱峰，则所述待测样品为牛乳；或

117、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合3的质谱峰，且不出现所述多肽组合1、多肽组合2和多肽组合4至7的质谱峰，则所述待测样品为水牛乳；或

118、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合4的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至3和多肽组合5至7的质谱峰，则所述待测样品为牦牛乳；或

119、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合5的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至4、多肽组合6和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为山羊乳；或

120、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽15的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至7的质谱峰，则所述待测样品为绵羊乳；或

121、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合6的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至5和多肽组合7的质谱峰，则所述待测样品为驴乳；或

122、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合7的质谱峰，且不出现所述多肽组合1至6的质谱峰，则所述待测样品为马乳；或

123、若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现所述多肽组合1至7的质谱峰中的两者或以上，则所述待测样品为多种动物混合乳或掺假乳。

124、本发明还提供了检测骆驼乳源性成分的方法，包括如下步骤：

125、步骤(a)：对待测样品进行质谱前处理，获得待测多肽液；

126、步骤(b)：通过质谱法检测上述多肽x或上述多肽组合y，以及步骤(a)所述待测多肽液，获得质谱检测谱图，通过比较所述质谱检测谱图判断所述待测样品是否含有骆驼乳源性成分；

127、所述判断包括：若所述待测多肽液的质谱检测谱图出现上述多肽x的质谱峰或上述多肽组合y的质谱峰，则所述待测样品含有骆驼乳源性成分；

128、其中，x选自1～4中的任一整数；

129、y取值为1。

130、在本发明的一些具体的实施方案中，上述方法中，所述多肽x中的x选自2～4中的任一整数。

131、在本发明的一些具体的实施方案中，上述方法中所述质谱前处理包括对所述待测样品进行脱脂、沉淀蛋白和复溶蛋白的步骤；

132、具体包括如下步骤：

133、步骤(a)：溶解所述待测样品，冷冻，离心，除去脂肪层，获得脱脂乳；

134、步骤(b)：取步骤(a)所述脱脂乳与含甲酸的乙腈混合，冷冻，离心，齐去上清，获得沉淀；

135、步骤(c)：取步骤(b)所述沉淀与含6mol/l尿素的50mmol/l nh4hco3溶液混合，震荡，获得复溶液；

136、步骤(d)：对步骤(c)所述复溶液进行还原、烷基化、酶解和过滤，获得所述待测多肽液。

137、本发明的多肽组合及应用有如下效果：

138、所述的多肽组合中的多肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和子离子)，骆驼奶特征多肽在其他7种动物奶中未见存在。经试验验证：

139、1、本发明的骆驼乳源性多肽特异性良好，无干扰峰；

140、2、本发明的骆驼乳源性多肽的质谱峰在牛乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、驴乳或马乳的质谱检测谱图中未见存在；

141、本发明的牛乳源性多肽、水牛乳源性多肽、牦牛乳源性多肽、山羊乳源性多肽、绵羊乳源性多肽、驴乳源性多肽或马乳源性多肽的质谱峰在骆驼乳的质谱检测谱图中未见存在；

142、3、本发明的检测/鉴别乳品的方法中，对待测样品的质谱前处理方法具有提高肽段响应强度的效果。