一种基于磁性共价有机框架材料构建生物传感器检测乙型肝炎病毒的方法

本发明属于功能材料和生物传感，具体涉及了一种磁吸附比色免疫生物传感器的制备及乙肝病毒检测的方法。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hbv)是目前已知可导致病毒性肝炎的病毒之一。全世界hbv感染者达20多以，其中3.5亿是慢性乙肝病毒携带者。慢性病毒携带者发生并发症的风险较高，并发症包括：慢性肝炎、肝硬化等。血清学标志物通常作为急性或慢性hbv感染的诊断或预后指标。有研究报道，血清hbv dna检测具有急性、慢性hbv感染预后预测价值。

2、传统的检测方法有酶联免疫吸附测定法(elisa)、real-time rt-pcr和微粒化学发光法等，elisa方法可以直接使用抗体或抗原捕获乙肝表面抗原和表面抗体、e抗原和e抗体、核心抗原和抗体，并通过携带探针的抗体进行显色测定；real-time rt-pcr是通过提取病毒rna，设计并合成引物和探针，用定量pcr仪进行荧光定量。elisa法具有操作简单、灵敏度高、检测快速等特点，但是因各种试剂诊断灵敏度及特异性相差大，且具有成本高，前期试剂准备复杂的缺陷；real-time rt-pcr法的特点是可以具有目的性的检测乙肝病毒，但其检测系统技术要求严格，具有成本高等特点。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种基于磁性共价有机框架材料构建生物传感器检测乙型肝炎病毒的方法。本发明的目的在于通过把乙肝病毒特异性识别探针组装在金纳米粒子和cuo上，构成一种可以捕获乙肝病毒的捕获探针和信号探针复合体，将病毒颗粒捕获并固定，形成三明治结构。然后用负载了捕获探针的磁性复合共价有机框架纳米材料来识别体系中的病毒，同时利用纳米材料cuo的漆酶活性，可使4-ap和2，4-dp变红，在510nm光波显示出特征峰，最后在400μl浓度为50mmol/l，ph＝6.8的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲溶液中进行显色反应，构成一种可快速有效检测样品中乙肝病毒浓度的生物传感器。

2、在本发明中，磁性复合共价有机框架纳米材料(aunps@znfe2o4@cof)作为新一代复合纳米材料，具有良好的吸附性，能极大程度分散于水中，可以结合探针、抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子等特点。同时，cuo纳米材料具有良好的漆酶活性，可以使信号分子4-氨基吡啶(4-ap)和2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-dp)显现出红色，并在510nm处出现特征峰。

3、根据对乙肝病毒全基因组分析后，我们根据乙肝病毒核心区设计了信号探针并对其进行了3’端巯基修饰。探针上的巯基可与金纳米粒子通过自组装形成金硫键(au-s)，也可以与cuo相接，加之探针可特异性识别乙肝病毒的特点，再与磁性复合共价有机框架纳米材料共同作用下，构建了一个具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度、较低的检出限以及操作方便等优点的hbv生物传感器。

4、本发明采用如下技术方案实现。

5、1.根据之前的文献报道合成znfe2o4@cof，并表征。

6、(1)合成znfe2o4，用乙二醇溶解六水合氯化铁和无水氯化锌，形成透明溶液，随后加醋酸钠和聚乙二醇20000。混合液剧烈搅拌0.5-2h后，转移到不锈钢高压釜(容量50ml)中，在200℃条件下反应6-10h，反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗数次，黑色产物在60℃真空环境下干燥4-8h，收集样品用于后续实验和表征。

7、(2)进一步合成znfe2o4@cof，取1，3，5-三(4-氨基苯基)苯(tapb)，对苯二甲醛(tpa)和znfe2o4，用二甲基亚砜溶解。超声分散，超声下加入无水乙酸，室温反应。磁铁收集znfe2o4@cof，分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次，60℃真空干燥，收集样品用于后续实验和表征。

8、表征方法有：红外光谱，扫描电镜图像，透射电镜图像，eds元素分析，zeta电位，xrd粉末x射线衍射图谱，xps光电子能谱。

9、2.合成并表征au@znfe2o4@cof纳米复合材料。

10、(1)合成aunps，将0.5-2ml浓度为10-30mmol/l的haucl4溶液加入到50-200ml去离子水中，在80-120℃下加热搅拌2-10min，加入5-20ml浓度为10-20mmol/l的柠檬酸钠溶液，回流20-40min，直至溶液变为酒红色，自然冷却至室温，并于4℃下储存。

11、(2)将得到znfe2o4@cof粉末样加水配制成浓度为1-5mg/ml的znfe2o4@cof溶液，取1-5ml znfe2o4@cof溶液滴加在2-20ml浓度为0.0001-0.0005mol/l金纳米粒子(aunps)溶液中，4℃搅拌12h，离心洗涤，得到au@znfe2o4@cof纳米复合材料。

12、表征方法有：透射电镜图像，eds元素分析，zeta电位，xrd粉末x射线衍射图谱，xps光电子能谱。

13、3.合成cp@au@znfe2o4@cof纳米复合材料。

14、将乙肝病毒捕获探针(cp)加入到au@znfe2o4@cof纳米复合材料溶液中，4℃震荡12h，加入己硫醇(ht)封闭，磁吸附洗涤备用。

15、4.合成cuo纳米材料。

16、将聚乙烯吡咯烷酮(pvp)与cucl2·h2o充分溶解于去离子水中，随后加入naoh于溶液中，最后加入h2o2，搅拌30min，用去离子水离心洗涤，60℃真空干燥。

17、5.合成lp@cuo

18、将的乙肝病毒信号探针(lp)加入到的cuo纳米材料溶液中，室温震荡8h，加入己硫醇封闭，离心洗涤备用。

19、6.探究体系显色反应条件。

20、(1)最佳反应ph值

21、配制ph＝3.0-9.0 50mmol/l mes溶液。取cp@au@znfe2o4@cof加入2ml离心管内，加入10-10mol/l hbv dna靶标物，室温孵育，磁吸附清洗3次，加入lp@cuo，室温孵育15min，磁吸附清洗3次。最后加入400μl 50mmol/l不同ph值的mes缓冲溶液，同时加入4-ap和2，4-dp，在60℃下显色15min。吸取上清液测量510nm处的吸收峰。检测结果为ph＝6.8的mes缓冲溶液具有最高吸收峰值，是最优条件。

22、(2)最佳反应温度

23、取cp@au@znfe2o4@cof加入2ml离心管内，加入10-10mol/l hbv dna靶标物，室温孵育15min，磁吸附清洗3次，加入lp@cuo，室温孵育15min，磁吸附清洗3次。最后加入不同ph值的mes缓冲溶液，同时加入4-ap和2，4-dp，分别在30℃-70℃下显色15min。吸取上清液测量510nm处的吸收峰。检测结果为60℃后最高吸收峰值不在大幅度改变，所以60℃为最优温度。

24、(3)cp最佳反应时间

25、取cp@au@znfe2o4@cof加入2ml离心管内，加入10-10mol/l hbv dna靶标物，室温孵育5min、10min、15min、30min、45min、60min、75min、90min，磁吸附清洗3次，加入lp@cuo，室温孵育时间从15min，磁吸附清洗3次。最后加入mes缓冲溶液，同时加入4-ap和2，4-dp，在60℃下显色15min。检测结果为室温孵育15min后具有最高吸收峰值，所以cp@au@znfe2o4@cof孵育15min为最优孵育时间。

26、(4)lp最佳反应时间

27、取cp@au@znfe2o4@cof加入2ml离心管内，加入10-10mol/l hbv dna靶标物，室温孵育15min，磁吸附清洗3次，加入lp@cuo，室温孵育时间从5min、10min、15min、30min、45min、60min、75min、90min，磁吸附清洗3次。最后加入mes缓冲溶液，同时加入4-ap和2，4-dp，在60℃下显色15min。检测结果为室温孵育15min后具有最高吸收峰值，所以lp@cuo孵育15min为最优孵育时间。

28、7.乙肝病毒的测定步骤。

29、(1)取50-200μl 1μmol/l cp@au@znfe2o4@cof加入2ml离心管内，加入50-200μl10-10mol/l hbv dna靶标物，室温孵育15min。使用pbst溶液磁吸附清洗3次。

30、(2)加入50-200μl 1μmol/l lp@cuo，室温孵育时间从15min。使用pbst磁吸附清洗3次。

31、(3)加入200-800μl 50mmol/l ph＝6.8的mes缓冲溶液，同时加入50-200μl 1mg/ml4-ap和50-200μl 1mg/ml 2，4-dp，在60℃下显色15min。

32、(4)吸取上清液使用紫外分光光度计测量400-700nm处的吸收峰值，并记录510nm处的最高吸收峰值，记录并绘制工作曲线。

33、除上述技术方案之外，本发明可以用来识别乙肝病毒的分子还可以是其他生物分子，比如乙肝病毒抗体以及适配体。本发明中的znfe2o4@cof还可用其他共价有机骨架材料替代。本发明中的cuo还可用其他具有漆酶活性的纳米材料替代。

34、本发明的有益效果为，1.由透射电镜可以看出，znfe2o4呈现为均匀且分散的球形，尺寸大小约为100-200nm，当znfe2o4与cof复合之后，在znfe2o4表面可以明显观察到一层薄薄的cof壳层，厚度约为30nm，包裹在znfe2o4磁芯的周围，这些结果说明cof成功复合到了znfe2o4表面；aunps颗粒均匀且均匀的分布在znfe2o4@cof上。以上结果证明了au@znfe2o4@cof材料已合成成功。

35、2.x射线衍射(xrd)结果显示制备的znfe2o4具有明显的尖晶石结构，在62.5o、56.8o、53.2o、43.0o、35.4o和30.0o出现衍射峰，而且，在负载上cof之后，这些衍射峰并未出现明显的偏移，说明cof在znfe2o4表面上的聚合并未改变znfe2o4的晶体结构，也说明了znfe2o4@cof的成功合成。

36、3.红外光谱显示在3430cm-1处均具有一个较大的伸缩振动峰，这归属于残留水的羟基(-oh)的伸缩振动。2920cm-1和2850cm-1处的吸收峰与c-h键有关；1630cm-1和1402cm-1处的吸收峰为c＝o和c-o的伸缩振动峰。这些峰显示了znfe2o4mnps表面羧基的红外吸收特性。而550cm-1左右的吸收峰归属于zn-o-fe的振动。相比于znfe2o4，znfe2o4@cof的红外光谱中出现了cof中特有的两个吸收峰，位于1700cm-1和1489cm-1处，分别对应酰胺键的c-n键变形振动和苯环的c＝c伸缩振动，这说明了缩醛反应中cof壳层的形成。

37、4.zeta电位测试结果显示，znfe2o4的平均zeta电位为23.83mv，cof的平均zeta电位为13.21mv，已知aunps粒子的zeta电位为负值，au@znfe2o4@cof平均zeta电位为-32.78mv，表明已成功将aunps负载在znfe2o4@cof上。

38、5.光电子能谱(xps)结果也可以明显地看到znfe2o4的zn、fe元素和znfe2o4@cof的c、n元素，也进一步证明了znfe2o4和znfe2o4@cof的成功制备。

39、6.由tem图可知，cuo为直径10nm左右的球形粒子且分散性较好。

40、7.随着乙肝病毒浓度增加，紫外分光光度计检测到的光学信号增强，且在10-18-10-8mol/ml的乙肝病毒浓度范围内具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计510nm处的吸收峰值变化，取每个浓度的吸收峰值，进行数据分析，以病毒浓度的对数为x轴，吸光度值为y轴，构建标准曲线，得到的标准曲线方程为y＝0.0461log[c]+1.1769(r2＝0.9931)

41、8.在没有asfv加入的情况下，传感器对牛血清蛋白(bovine albumin，bsa)、溶菌酶(lysozyme)、大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、na+、mg2+、k+、ca2+、zn2+、hcvdna，都没有信号响应，当在混合物中加入标准品hbv后(hbv+mix)，传感器有明显的信号响应，说明该传感器能够特异性检测hbv。

42、本文成功制备了au@znfe2o4@cof纳米复合材料与cuo纳米材料。au@znfe2o4@cof纳米复合材料可以与乙肝病毒捕获探针有效结合并特异性识别hbv dna，在lp@cuo的辅助作用下，富集并放大信号，最后通过cuo所具有的漆酶活性，在510nm处测出最高吸收峰值。同时，cp、lp可以特异性识别乙肝病毒，并与目标物形成三明治夹心结构，所构建的生物传感器对乙肝病毒具有特异性识别能力，制备得到的传感器的线性检测范围是10-18-10-8mol/l。

43、下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。