神经干细胞标志物的流式检测方法与流程

本发明涉及一种神经干细胞标志物的流式检测方法，属于细胞生物学检测领域。

背景技术：

1、流式细胞技术(flow cytometry，fcm)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是当前最先进的细胞定量分析技术之一。目前，流式细胞技术主要应用于：(1)dna倍体分析；(2)借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；(3)细胞分选和细胞收集；(4)医学应用；(5)应用于外周血内皮细胞测定、调节性t细胞等尖端领域。

2、虽然流式检测是一个公开的检测技术，但在行业内，受体阻断、固定、破膜等参数较随意，并没有形成标准化的方案，特别在细胞工艺研究过程中，稳定性及重复性较差，缺乏标准的流式检测方法。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种神经干细胞标志物的流式检测方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种神经干细胞标志物的流式检测方法，包括以下步骤：

4、(1)样本洗涤：向待检测的神经干细胞样本中加入适量洗涤液，离心，并重复一次；

5、(2)受体阻断：用pbs缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度，加入fc受体阻断剂，孵育；

6、(3)细胞固定：向细胞悬液中加入fixation buffer固定剂，孵育；

7、(4)细胞破膜：加入破膜液perm bufferⅲ，孵育；

8、(5)细胞染色：加入相应的抗体，孵育；所述抗体为nestin抗体、sox1抗体和sox2抗体；

9、(6)数据分析：进行流式检测，对nestin+、sox1+sox2的表达进行分析。

10、进一步地，所述步骤(1)中，洗涤液，是向pbs缓冲液中加入1％(体积百分数)的fbs(胎牛血清)配制而成的。

11、进一步地，所述步骤(1)中，离心条件为：4℃，500g离心5min，升9降9。

12、进一步地，所述步骤(2)中，调整细胞密度至1*106/100μl。

13、进一步地，所述步骤(2)中，fc受体阻断剂的用量为：每100μl细胞悬液中含有5～10μl fc。

14、进一步地，所述步骤(3)中，fixation buffer固定剂的用量为：每150μl细胞悬液中加入250μlfixation buffer固定剂。

15、进一步地，所述步骤(4)中，破膜液的用量为：每150μl细胞悬液中加入1ml破膜液。

16、进一步地，所述步骤(5)中，加入nestin抗体的浓度为0.2mg/ml，sox2抗体的浓度为0.2mg/ml，sox1的浓度为0.125mg/ml。

17、进一步地，所述步骤(2)中，孵育的具体条件为室温孵育5～10min；所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育的具体条件均为4℃孵育30～40min。

18、进一步地，所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育后，加入适量洗涤液，进行离心洗涤。

19、本发明的神经干细胞标志物的流式检测方法，是借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的检测技术，其中受体阻断、固定、破膜条件等过程经过优化，重复性高，稳定性好，大大解决了在工艺研发过程中流式检测不稳定的问题。本发明提供的标准的神经干细胞标志物的流式检测方法，为神经干药物的工艺开发提供了依据，同时，也可以为其他类型的细胞提供技术支持。

技术特征：

1.一种神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，洗涤液是向pbs缓冲液中加入1％的fbs配制而成的。

3.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：进一步地，所述步骤(1)中，离心条件为：4℃，500g离心5min，升9降9。

4.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，调整细胞密度至1*106/100μl。

5.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，fc受体阻断剂的用量为：每100μl细胞悬液中含有5～10μl fc。

6.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，fixation buffer固定剂的用量为：每150μl细胞悬液中加入250μlfixation buffer固定剂。

7.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，破膜液的用量为：每150μl细胞悬液中加入1ml破膜液。

8.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中，加入nestin抗体的浓度为0.2mg/ml，sox2抗体的浓度为0.2mg/ml，sox1的浓度为0.125mg/ml。

9.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，孵育的具体条件为室温孵育5～10min；所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育的具体条件均为4℃孵育30～40min。

10.根据权利要求1所述的神经干细胞标志物的流式检测方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)、(5)中，孵育后，加入适量洗涤液，进行离心洗涤。

技术总结
本发明公开了一种神经干细胞标志物的流式检测方法，包括以下步骤：(1)样本洗涤；(2)受体阻断：加入Fc受体阻断剂，孵育；(3)细胞固定：向细胞悬液中加入Fixation Buffer固定剂，孵育；(4)细胞破膜：加入破膜液Perm BufferⅢ，孵育；(5)细胞染色：加入相应的抗体，孵育；所述抗体为Nestin抗体、Sox1抗体和Sox2抗体；(6)数据分析：进行流式检测，对Nestin+、Sox1+Sox2的表达进行分析。本发明的神经干细胞标志物的流式检测方法，受体阻断、固定、破膜条件等过程经过优化，重复性高，稳定性好，解决了在工艺研发过程中流式检测不稳定的问题。

技术研发人员：杨敏,陈小威,刘使君,刘昌明,朱紫薇,宁文洁,张换红,郭红玉
受保护的技术使用者：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12