一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒。


背景技术：

2.苏丹黑b(sudanb l ack b su)是一种亲脂性染料，可溶解于细胞质内的含脂质结构中，使胞质中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒。斑马鱼成熟中性粒细胞上具有大量含脂质结构膜包裹的颗粒，因此苏丹黑b能够大量聚积在斑马鱼中性粒细胞中使其着色。
3.斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，由于它具有体积小，繁殖周期快，胚胎透明，骨骼发育迅速，与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，而逐渐被应用于各种疾病模型的研究。
4.当前，现有对斑马鱼中性粒细胞染色的实验繁琐，操作复杂。
5.因此，现在有必要提供一种能够快速，高效地提高斑马鱼中性粒细胞染色效果，便于直接观察到中性粒细胞具体情况的方案。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术中的不足之处，提供一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
8.一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂，其特征在于，包括苏丹黑b备用液，缓冲液，固定液，漂白液，清洗液，保存液和10
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pbst的缓冲液。
9.进一步的，所述苏丹黑b备用液通的制备方法为：
10.1)将苏丹黑b粉末溶于无水乙醇中，搅拌；
11.2)充分溶解后，将产物过滤，4℃保存，即得所述苏丹黑b备用液。
12.进一步的，所述10
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pbst缓冲液通过以下方法制备得到：
13.1)将苯酚加入无水乙醇中溶解；
14.2)将磷酸氢二钠溶于蒸馏水中；
15.3)将步骤1)和步骤2)得到的溶液混合，即得所述缓冲液。
16.进一步的，所述固定液包括：体积百分比为4％的多聚甲醛；
17.所述漂白液包括：体积百分比为6％的过氧化氢，1％的氢氧化钾，充分混合，现配现用；
18.所述清洗液，保存液包括：体积百分比为25％-50％的甘油以及0.1％的氢氧化钾；
19.所述10
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pbst缓冲液的ph为7.4，该缓冲液包括：氯化钠，磷酸氢二钠，氯化钾，磷酸二氢钾以及tween。
20.一种对斑马鱼中性粒细胞进行染色的方法，其特征在于，包括步骤：
21.1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；
22.2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；
23.3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵，随后放入恒温培养室培养；(恒温孵育的温度为28.5℃，时间为4天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育)；
24.4)取步骤3)培养后的样品进行苏丹黑b染色；
25.所述苏丹黑b染色的方法具体为：
26.a：取样：取步骤3)中受精卵培养第4天后的斑马鱼，用固定液固定24小时。
27.b：洗涤：用1xpbst洗2-3次，每次10mi n，吸干净溶液；
28.c：苏丹黑b染色液制备：将苏丹黑b备用液与缓冲液按3:2比例混合，得到苏丹黑b染色液；
29.d：苏丹黑b染色：将苏丹黑b染色液加入样品管内，避光染色30-60分钟；
30.e：洗涤：弃去管内苏丹黑b染色液，加入70％乙醇，多次洗涤，直到染色信号清晰可见；
31.f：脱色处理：弃去管内70％乙醇，加入漂白液去色素，每10分钟观察一次，直到色素完全去除为止；
32.g：洗涤：弃去管内漂白液，加入清洗液，多次洗涤至无气泡；
33.h：保存：弃去管内清洗液，加入保存液4℃保存；
34.i：拍照：100％甘油中拍照。
35.一种对斑马鱼中性粒细胞进行染色方法的用途，用于在斑马鱼体内分析中性粒细胞的分布情况。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
37.本发明能够直接观察检测中性粒细胞，特别的，本发明进一步提供了一种如上所述的斑马鱼苏丹黑染色方法，其能用于评价斑马鱼体内中性粒细胞具体情况。
38.与现有技术相比，本发明具有简便，快速，高效，成功率高，重复性好且稳定等优点，便于实现定性分析与定量分析。
附图说明
39.图1为斑马鱼幼鱼的中性粒细胞染色图像示意图。
具体实施方式
40.下面结合附图对本发明的较佳实施例作详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
41.本发明提供了一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒，包括：苏丹黑b备用液，缓冲液，固定液，漂白液，清洗液，保存液，10
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pbst缓冲液；所述中性粒细胞可通过本试剂盒染色在显微镜下清晰观察。
42.本发明还提供了一种基于该试剂盒的中性粒细胞检测方法，可用于检测包括中性粒细胞分布情况在内的多种参数。
43.以下提供具体的实施例，以对本发明作进一步说明。
44.实施例1一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒：
45.本实施例提供一种斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒，包括：苏丹黑b备用液，缓冲液，固定液，漂白液，清洗液，保存液，10
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pbst缓冲液。
46.其中，苏丹黑b备用液，3μg/ml；
47.其中，缓冲液包括：苯酚，无水乙醇，磷酸氢二钠；
48.漂白液包括：6％的过氧化氢，1％的氢氧化钾；
49.清洗液，保存液包括：25％-50％的甘油以及0.1％的氢氧化钾；
50.10
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pbst缓冲液的ph为7.4，该缓冲液包括：氯化钠，磷酸氢二钠，氯化钾，磷酸二氢钾以及tween。
51.实施例2一种斑马鱼中性粒细胞染色方法：
52.本实施例采用实施例1的试剂盒对斑马鱼中性粒细胞进行检测，其方法包括以下步骤：
53.1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；
54.2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；
55.3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵，随后放入恒温培养室培养；(恒温孵育的温度为28.5℃，时间为4天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育)；
56.4)取步骤3)培养后的样品进行苏丹黑b染色。
57.进一步地，所述苏丹黑b染色的方法具体为：
58.a：取样：取步骤3)中受精卵培养第4天后的斑马鱼，用固定液固定24小时。
59.b：洗涤：用1xpbst缓冲液洗2-3次，每次10mi n，吸干净溶液；
60.c：苏丹黑b染色液制备：将苏丹黑b备用液与缓冲液按3:2比例混合，得到苏丹黑b染色液；
61.d：苏丹黑b染色：将苏丹黑b染色液加入样品管内，避光染色30-60分钟；
62.e：洗涤：弃去管内苏丹黑b染色液，加入70％乙醇，多次洗涤，直到染色信号清晰可见；
63.f：脱色处理：弃去管内70％乙醇，加入漂白液去色素，每10分钟观察一次，直到色素完全去除为止；
64.g：洗涤：弃去管内漂白液，加入清洗液，多次洗涤至无气泡；
65.h：保存：弃去管内清洗液，加入保存液4℃保存；
66.i：拍照：100％甘油中拍照。
67.对实施例2染色后的斑马鱼进行显微镜观察拍照，如图1即斑马鱼幼鱼的中性粒细胞染色结果。通过软件image-pro-p l us 6.0对图像进行分析，计算斑马鱼的中性粒细胞数目。
68.实施例2成功运用斑马鱼中性粒细胞染色试剂盒观察到幼鱼中性粒细胞的情况，并且该方法具有简便，快速，高效，成功率高，重复性好且稳定可靠等优点，能实现定性分析与定量分析。
69.以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权
利要求书中记载的保护范围内。