1.本发明涉及内毒素检测技术领域，具体为一种内毒素清洗试验的检测方法。
背景技术：
2.内毒素(endotoxin，et)是构成革兰阴性细菌细胞壁外膜最外层的脂多糖(lps)成分，其基本结构高度保守，由特异性侧链、核心多糖和类脂a(lipida)组成。内毒素的活性中心是类脂a，是已知最强的免疫刺激物之一。可通过刺激单核细胞和巨噬细胞，使其产生白细胞介素-1(il-1)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)、巨噬细胞炎症蛋白-1(mip-1)、白细胞致热源(lp)等炎症介质和细胞因子。内毒素的生物活性很广泛，主要通过与靶细胞作用而诱导这些细胞产生一系列炎症介质和细胞因子表现出来，可引起发热反应，促进前列腺素合成，促使血管活性物质的释放，降低血压，激活凝血系统和补体，引起局部过敏，影响或参与免疫反应，影响血糖及肿瘤坏死等，严重的会致死。由于此类物质可能致人产生严重不良反应，因此在药物注射剂中均需要严格控制。
3.1956年美国人bang发现美洲鲎血液遇革兰阴性菌时会产生凝胶。其后levin和bang也发现微量革兰阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经提纯、冷却、低温冷冻干燥后呈粉末状的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。鲎试剂因能与细菌内毒素及β-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。但是，制备鲎试剂主要来源于东方鲎和美洲鲎，因此主要有中、美、日、德等少数国家才有生产鲎试剂。同时，鲎长到成年需漫长的8年，每只雌鲎可产卵8万粒，可采血50毫升。杀鲎取血不仅满足不了需求而且会使鲎资源枯竭。
4.2021年2月，国家林业和草原局、农业农村部颁布公告，将中国鲎和圆尾鲎列为国家二级保护野生动物。随即，多家鲎试剂生产商公告将定时停止供应数种资源消耗严重的产品。寻求新的检测方法替代传统鲎试剂法迫在眉睫。
5.在控制注射剂内毒素的过程中，对设备进行内毒素清洗试验较为普遍，确认被污染的胶塞通过清洗后，可将细菌内毒素污染物下降103数量级，确定清洗机的性能及清洗方法的可靠性，从而保障药品的安全性。
6.按照《药品gmp指南》(无菌药品)的要求，内毒素应进行样品的回收试验，回收率通常不低于25％。在满足能够反映3个对数级降低的条件下，应尽可能降低内毒素的涂布量。验证过程使用的非挑战性容器可以在后期验证时使用，但必须考虑该批容器可能在微粒方面的增加。
7.传统的内毒素检测方法为凝胶法。系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。但因为仅可以进行定性或半定量测定，无法直观判断试验结果，且鲎试剂用量较多，存在不经济、不环保的问题。
8.我们采用酶标仪，通过动态显色法开发了一种内毒素清洗试验的检测方法，该方
法抗干扰能力强，使用简单方便，检测范围宽，灵敏度高，且鲎试剂用量仅传统方法用量的1/8，一次可同时检测多达96个样品。具有高效、精准、环保、经济的特点。
技术实现要素：
9.本发明的目的在于提供一种内毒素清洗试验的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
10.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
11.一种内毒素清洗试验的检测方法，包括以下步骤：
12.s1：内毒素检测标准曲线的建立；
13.s2：通过内毒素取样回收率试验、内毒素检测干扰试验确定取样试验回收率、干扰试验回收率，在50％～200％之间；
14.s3：制备试验样品，清洗机清洗后，检测内毒素含量，并计算内毒素下降指数级f。
15.进一步的，所述内毒素检测标准曲线的建立，包括以下步骤：
16.取内毒素标准品，复溶，分别稀释至不同浓度，得到内毒素标准溶液；加入鲎试剂，置于酶标仪中反应；得到内毒素检测标准曲线。
17.进一步的，所述内毒素检测标准曲线线性回归方程为：
18.lgtg＝2.9276-0.2838lgc，相关系数：-1.0000，绝对值≥0.980；
19.其中tg为达限时间，c为浓度。
20.进一步的，所述内毒素取样回收率试验的方法，包括以下步骤：
21.取若干普通胶塞，在每只胶塞嘴部平均滴加内毒素指示剂，涂布内毒素，在层流下自然吹干，于水中振荡，稀释，得到取样回收率供试溶液；通过标准曲线计算取样回收率供试溶液的内毒素含量c
取样
，计算得到内毒素取样回收率。
22.进一步的，所述内毒素取样回收率计算公式为：
23.取样回收率＝(c
取样
/取样回收率供试液理论值)
×
100％。
24.进一步的，所述内毒素检测干扰试验的方法，包括以下步骤：
25.取浓度为0.1eu/ml的内毒素标准溶液和取样回收率供试溶液，混合均匀，得到干扰试验检验溶液；通过标准曲线计算供试溶液的内毒素含量c
干扰
，得到干扰试验回收率。
26.进一步的，所述干扰试验回收率计算公式为：
27.干扰试验回收率＝(c
干扰
/干扰试验检验溶液理论计算值)
×
100％。
28.进一步的，所述步骤s3包括以下步骤：
29.取若干胶塞，在每只胶塞嘴部平均滴加内毒素指示剂，涂布内毒素，在层流下自然吹干，清洗机清洗；清洗结束后，每个瓶子取等量的加标清洗胶塞，于水中振荡，得到供试品溶液；通过标准曲线计算供试溶液的内毒素含量，计算得到内毒素下降指数级f。
30.进一步的，所述内毒素下降指数级f计算公式为：
31.f＝logm—logn；
32.其中，f表示试验的结果；
33.m表示胶塞接种内毒素的总量，
34.n表示清洗后胶塞内毒素检测值：
35.n＝c
取样
eu/ml
×
10ml/50％。
36.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明采用酶标仪通过动态显色法进行内毒素清洗试验的检测，该方法抗干扰能力强，使用简单方便，检测范围宽，灵敏度高，鲎试剂用量少，样品检样量大。
37.(1)能准确定量。
38.传统方法所用鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试，使用时加细菌内毒素检查用水复溶后使用。仅可以进行定性或半定量测定。
39.本方法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色而释放出的呈色团的多少来测定内毒素含量，根据产物颜色判断内毒素浓度，结果浓度可精确到10-5。精准度大大提高，是传统检测方法未曾企及的。
40.(2)检测范围宽。
41.本方法检测范围可达4个数量级。
42.(3)灵敏度高。
43.本方法检测限为0.01eu/ml，且重现性良好。可更细致反馈清洗后内毒素的残留情况，是在内毒素清洗试验检测方法中运用的首创。
44.(4)操作简便、高效。
45.传统方法为将等量的被检样品与鲎试剂混匀，放入水浴中让其充分反应，然后取出观察凝胶形成的情况。实验时配制试验管、阳性对照管、阴性对照管及阴性抑制对照管。操作繁琐，耗时耗力。
46.本方法系统自动检测分析，一步即成，检测效率高。
47.(5)试剂样品需要量少，经济环保。
48.传统方法单样的鲎试剂使用量一般在100μl，本方法可降至25μl。且不必配制多种对照，试剂和样品的需要量均可大大减少。由此可大大降低鲎试剂的使用量，降低经济成本的同时也响应国家政策，保护我国野生鲎资源，维持生态平衡和物种平衡，更为环保。
49.(6)批检测量大。
50.本方法一次可同时检测多达96个样品，在同一时间自动出检测结果。一次检测即可完成整个内毒素清洗试验的所有样品检测。
具体实施方式
51.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
52.以下实施例中所用内毒素清洗试验的清洗方法为以超声波胶塞清洗机清洗。真空脱泡与汽水冲击等清洗方式同样可适用于本检测方法进行样品检测和效果评估。
53.s1：验证酶标仪检测内毒素清洗试验样品；
54.s11：制备内毒素检测标准曲线；
55.s111：内毒素标准溶液的制备：
56.按照厂家提供的效价分析报告书确定标准品的效价和复溶体积。取1支内毒素标准品(90eu/支)，按照说明将其复溶，得到复溶溶液；取0.2ml复溶溶液+1.6ml检查用水，得
到e
10
；取0.2mle10+1.8ml检查用水，得到e1；取0.2mle1+1.8ml检查用水，得到e
0.1
；取0.2mle
0.1
+1.8ml检查用水，得到e
0.01
。其中e
10
、e1、e
0.1
、e
0.01
的浓度依次为10eu/ml、1eu/ml、0.1eu/ml、0.01eu/ml。
57.取鲎试剂，加入细菌毒素检查用水0.35ml复溶，轻轻摇匀，待溶液澄清后，备用。
58.s112：加样及反应：
59.取微孔反应板，加入细菌内毒素检查用水至阴性对照孔，平行2孔；加入内毒素标准溶液e
10
、e1、e
0.1
、e
0.01
至相应反应孔，每个浓度平行3孔；每孔加入鲎试剂，将微孔反应板置于酶标仪中反应。
60.s113：结果计算：
61.以浓度的对数值为横坐标，达限时间的对数值为纵坐标作线性回归曲线。
62.s114：可接受标准：
63.标准曲线的相关系数(r)的绝对值应不小于0.980。
64.s115：结果：
65.线性回归方程：lgtg＝2.9276-0.2838lgc，相关系数：-1.0000，绝对值≥0.980。表明该方法在0.01-10eu/ml范围内线性关系良好。
66.s12：内毒素取样回收率试验；
67.s121：方法：
68.取5个生产用普通胶塞，在每只胶塞嘴部滴加0.25ml内毒素指示剂(4000eu/ml)，单只胶塞内毒素的布量为1000eu，在层流下自然吹干，全部取出浸泡于10ml检查用水振荡1小时，稀释500倍后作为取样回收率供试溶液。通过标准曲线计算供试溶液的内毒素含量c取样，求取样回收率。重复上述试验三次。
69.s122：计算：
70.取样回收率供试液理论值＝1000eu
×
5/10ml/500＝1eu/ml
71.取样回收率＝(c取样/取样回收率供试液理论值)
×
100％
72.s123：可接收标准：
73.标准曲线的相关系数r绝对值≥0.980。
74.取样回收率范围应在50％～200％之间。
75.s124：结果：
76.标准曲线的相关系数r为-1.0000，绝对值≥0.980。取样回收率分别为102.73％、58.30％、94.56％，均在50％～200％之间。
77.s13：内毒素检测干扰试验
78.s131：方法：
79.取步骤s12项下供试溶液0.5ml，加e
0.1
溶液0.5ml，混合均匀，作为干扰试验检验溶液。通过标准曲线计算供试溶液的内毒素含量c
干扰
。连续三次。
80.s132：计算：
81.干扰试验检验溶液理论值＝(c取样eu/ml+0.1eu/ml)
×
0.5ml/1ml
82.干扰试验回收率＝(c干扰/干扰试验检验溶液理论计算值)
×
100％
83.s133：可接收标准：
84.标准曲线的相关系数r绝对值≥0.980，各平行孔间的cv值均不超过20％。
85.干扰试验回收率范围应在50％～200％之间。
86.s134：结果
87.标准曲线的相关系数r为-1.0000，绝对值≥0.980，各平行孔间的cv值均不超过20％。干扰试验回收率分别为71.46％、96.53％、87.73％，均在50％～200％之间。
88.s2：内毒素清洗试验；
89.取15只红色胶塞，在每只胶塞嘴部滴加0.25ml内毒素指示剂(4000eu/ml)，单只胶塞内毒素得涂布量为1000eu，在层流下自然吹干，把接种后的15只红色胶塞混入清洗机最大清洗的普通胶塞中进行清洗。清洗结束后，用无热原的镊子将加标胶塞从清洗设备中取出，放入3个无热原取样瓶中，每个瓶子取5只红色的清洗胶塞，浸泡于10ml检查用水振荡1小时，取液体，为供试品溶液。通过标准曲线计算供试溶液的内毒素含量。重复上述试验三次。
90.s3：通过酶标仪检测内毒素清洗试验样品
91.s31：计算：
92.按公式：f＝logm—logn
93.其中：f表示试验的结果；
94.m表示5只胶塞接种内毒素的总量：
95.1000eu
×
5＝5000eu；
96.其中n表示清洗后5只胶塞内毒素检测值：
97.c取样eu/ml
×
10ml/50％(回收率按50％计)。
98.s32：可接收标准：
99.清洗后内毒素含量下降至少三个对数级，即f≥3。
100.s33：结果：
101.样品经清洗后，f最小值为3.36，大于3。
102.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。