一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法与流程

：本发明涉及利用稳定同位素比值质谱仪测定化合物中特定位点的稳定同位素比值，并以此检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，属于食品真实性领域的稳定同位素应用技术。

背景技术

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背景技术：

1、根据国家标准gb 15037-2006《葡萄酒》的规定，葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原料经全部或部分发酵而成的含有一定酒精度的发酵酒。三分工艺，七分原料，好的原料才会产出质量上乘的葡萄酒，这是葡萄酒行业的共识。因此，除特殊产品外，葡萄酒中不允许添加食用酒精，也不允许加糖发酵。然而在逐利思想下，一些不法企业会通过掺入酒精或加入糖、糖浆发酵来提高产量、降低成本，这侵犯了消费者权益，对正规厂商也造成了不公平竞争，影响葡萄酒行业的发展。

2、葡萄酒安全、质量与真实性技术是打击葡萄酒掺假造假的有效手段，是确保gb15037被贯彻施行的关键措施。稳定碳同位素技术能够检测葡萄酒中是否掺入碳-4植物糖(包括甘蔗糖、高果玉米糖浆)及其转化的酒精，国际葡萄与葡萄酒组织(oiv)和我国均制定了葡萄酒中乙醇碳同位素的分析方法标准，但由于碳同位素技术仅能检测出不同光合作用类型的糖类及其代谢物，而甜菜与葡萄的光合作用途径相同，因此碳同位素技术无法检测掺有甜菜酒精的葡萄酒或掺有甜菜糖的葡萄汁。

3、1981年，法国的martin等人开发了点特异性分馏-核磁共振(snif-nmr)技术检测葡萄酒乙醇中甲基位点上的d/h的方法，根据d/h的差异检测葡萄酒中的甜菜酒精成分。该方法已被欧盟技术委员会(cen)和国际葡萄与葡萄酒组织(oiv)采纳为官方方法标准，并且欧盟自1991年起开始以此标准为基础建立葡萄酒d/h数据库。但是，该方法存在两大技术难点：①需要通过特定微蒸馏系统从发酵液中分离提取高纯度乙醇，馏分中乙醇浓度应大于95％v/v且回收率高于96.5％，考虑到乙醇和水的互溶性特点，该微蒸馏系统需要特别定制；②使用核磁共振仪测定乙醇甲基位点的d/h，其原理是测定定量样品中甲基位点的氘的绝对含量，然而由于自然状态下氘的含量仅占氢原子的0.02％，因此为得到足够的信噪比和稳定性，单一样品的测定时间长达5h以上。由于上述微蒸馏系统为法国eurofins公司的专利产品，单套价格需160万人民币，并且样品蒸馏时间需要4h以上，因此，尽管早已有方法标准，但近年来，全球范围内能够熟练使用该方法并得到准确数据的实验室寥寥无几，我国至今尚无一单位能够运用该技术，这严重妨碍了我国在葡萄酒掺假检测领域的研究和应用。

4、在上述背景下，本发明开发了稳定氢同位素比值质谱技术，使用相对低成本的稳定同位素比值质谱仪测定乙醇甲基位点的氢同位素比值，并以此为基础检测葡萄酒中的甜菜酒精。该发明操作简单、分析快速且成本低廉，适合大批量样品的分析测试。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、(1)拟解决的问题

2、针对检测葡萄酒中甜菜酒精需配套snif-nmr的技术难题，提供一种简单、高效、低成本的解决方案，为葡萄酒真实性鉴别技术提供有效的分析手段。

3、(2)本发明的具体方案

4、使用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇中甲基位点氢同位素比值，分别确定真实葡萄酒样品和甜菜酒精乙醇甲基位点氢同位素比值的分布范围，将待测样品的乙醇中甲基位点氢同位素比值与分布范围对比进而得出结论。

5、具体实施步骤如下：

6、a)取一批真实葡萄酒、甜菜酒精和待检样品；

7、b)将样品稀释至乙醇浓度约3～5g/l，加入醋酸杆菌培养液后通入氧气，在密封条件下30℃发酵转化乙醇为乙酸；

8、c)向样品中加入氢氧化钙，反复震荡后取上清液进行冷冻干燥，取固体粉末待用；

9、d)向固体粉末中加入ph＝1的硫酸溶液，再用无水丙酮稀释至乙酸含量8g/l左右。

10、e)用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱测定乙酸的氢同位素比值(δ2h值)；

11、f)用甲基位点δ2h甲基值已知的乙酸标准物质(或工作标准样品)进行数据校正，校正后的结果即为乙醇甲基位点氢同位素比值；

12、g)确定真实葡萄酒和甜菜酒精转换的乙酸甲基位点δ2h值的分布范围，即乙醇甲基位点上的δ2h值分布范围。

13、h)将待测样品的上述δ2h值与真实葡萄酒的分布范围对比，若待测样品的“δ2h值+6‰”小于分布范围的最小值，则可判定待测样品中含有甜菜酒精，反之则不含。

14、(3)有益效果：

15、本发明建立了一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，方法操作简单、分析快速、成本低廉，适宜于葡萄酒中甜菜酒精的检测，有利于稳定同位素比值质谱技术和氢同位素技术在葡萄酒掺假检测领域的研究与应用。

技术特征：

1.一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于使用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇甲基位点的稳定氢同位素比值，可以配套使用高温裂解/元素分析仪，也可以配套使用气相色谱-高温裂解系统，优选配套气相色谱-高温裂解系统。

3.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于，步骤1)中将乙醇转变成乙酸时可以采用微生物发酵法，也可采用乙醇氧化法，优选密闭条件下的微生物发酵法。

4.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于，步骤2)中要用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值需要排除乙酸羟基氢和溶液水的干扰，然后用甲基位点氢同位素比值已知的乙酸(标准物质或工作标准)进行校正得出。

5.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于，甜菜酒精转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值小于葡萄酒，但由于稳定同位素比值质谱仪测定氢同位素比值的标准偏差要求为优于3‰，因此样品转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值的95％置信区间为测定值±6，当“测定值+6‰”小于葡萄酒的分布范围时，认为待测样品中含有甜菜酒精。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于采用微生物发酵法时需向样品中加入醋酸杆菌培养液，加入氧气后密封，在恒温条件下进行发酵处理。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于排除乙酸羟基氢的干扰采用先去除乙酸中羟基，然后在特殊条件下复溶、酸化乙酸。

8.根据权利要求4和权利要求7所述的方法，其特征在于除去乙酸的羧基氢原子的过程采用碱性试剂(碱性试剂优选氢氧化钙)中和法，通过形成乙酸盐的形式去除羧基氢，然后冷冻干燥得到含乙酸盐粉末，最后用稀硫酸溶液(溶液的水中δd值已知)复溶并酸化得到乙酸进行后续测试。

技术总结
本发明涉及一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，属于食品真实性领域的稳定同位素应用技术发明。包括以下步骤：(1)用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值；(2)确定葡萄酒和甜菜酒精转化乙酸甲基位点的氢同位素比值的分布范围；(3)测定待测样品转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值；(4)对比待测样品转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值测定结果和葡萄酒的分布范围，若待测样品测定结果+6‰小于葡萄酒分布范围的最小值，认为待测样品中含有甜菜酒精，反之则不含甜菜酒精。本发明利用稳定同位素比值质谱仪实现了葡萄酒中甜菜酒精的检测问题解决了当前需要特定蒸馏系统和专用核磁共振仪才能完成葡萄酒中甜菜糖检测的难题。本发明将促进稳定同位素分析技术的应用推广，也为今后含乙醇样品真实性评价和掺假检测提供了技术方法。

技术研发人员：钟其顶,王道兵,武竹英,岳红卫,张洛琪
受保护的技术使用者：中轻技术创新中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12