一种磷酸特地唑胺中有关物质的检测方法与流程

本发明涉及医药，具体涉及一种磷酸特地唑胺中有关物质的检测方法。

背景技术：

1、磷酸特地唑胺(tedizo1idphosphate)，中文化学名称为(r)-3-(4-(2-(2-甲基四唑-5-基)吡啶-5-基)-3-氟苯基)-5-羟甲基噁唑烷-2-酮磷酸酯，结构式如式i所示：

2、

3、磷酸特地唑胺由cubist制药公司开发，是一种嗯唑烷酮类抗生素，2014年6月通过fda审批，在美国上市，商品名为sivextro，临床用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。磷酸特地唑胺属于前药，在体内可被磷酸酶迅速转化为具有生物活性的特地唑胺(tedizo1id)，特地唑胺能够和细菌的核糖体50s亚基结合，从而抑制蛋白质的合成。磷酸特地唑胺的作用机制不同于其他抗菌素(如氯霉素和林可霉素)，不会与其他抗菌药发生交叉耐药现象，对革兰阳性菌(如葡萄球菌、肠道球菌、链球菌)、厌氧微生物(如类菌体、梭菌体)以及耐酸微生物(如结核分枝菌、鸟分枝菌)在内的人和动物病原体有较强的抗菌活性，其抗菌谱较广，且安全性和耐受性良好。

4、磷酸特地唑胺是新一代恶唑烷酮抗生素，与第一代恶唑烷酮抗生素利奈唑胺相比主要有以下三个优势：一是临床使用方便，患者依从性好，使用方法为每天一次，疗程为六天，而利奈唑胺的使用方法为每天两次，共十天；二是磷酸特地唑胺有注射剂和片剂两种剂型，方便临床切换用药、减少病人住院时间，从而降低患者治疗费用；三是磷酸特地唑胺的半衰期更长，这可以进一步降低药物使用剂量，在一定程度上减少不良反应的发生。

5、然而，磷酸特地唑胺在制备过程中由于合成路线较长，在生产过程中引入的起始物料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中产生的降解产物等杂质，导致磷酸特地唑胺成品中可能含有多种杂质(亦称为有关物质)。基于安全性和生产工艺实际情况，无害或低毒性的杂质可有一定限度的允许，但必须严格控制毒性较大、危害人体健康、无效或影响药物稳定性的杂质。因此，控制药物质量的关键指标之一就是对有关物质的分析测定。

6、磷酸特地唑胺中有关物质的分析测定的难点在于生产和贮藏过程中引入的多种杂质与主成分极性相近，难以分离；且磷酸特地唑胺的溶解性存在ph值依赖性，在低ph值难溶解，高ph值易溶解，在水及普通有机试剂中溶解度不高。目前，各国药典及药典论坛和中国药典2020年版中均没有收载磷酸特地唑胺的杂质分析测定方法。因此，开发磷酸特地唑胺的有关物质的有效的分析测定方法是很有必要的。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种磷酸特地唑胺中有关物质的检测方法，本发明提供的检测方法能够实现磷酸特地唑胺主成分与各有关物质间很好的分离，检测方法灵敏度、专属性优异。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种磷酸特地唑胺中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱对磷酸特地唑胺进行检测；

4、所述高效液相色谱的检测条件包括：

5、色谱柱：c18柱；

6、流动相体系包括流动相a和流动相b；

7、所述流动相a：缓冲溶液-乙二胺四乙酸二钠混合水溶液，所述流动相a的ph值为6～7；

8、所述流动相b：甲醇-乙腈混合溶液，所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇的体积分数为10～30％；

9、采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱的程序如下：0min，所述流动相a的体积分数为93～97％；0～30min，所述流动相a的体积分数由93～97％匀速降低至45～55％；30～35min，所述流动相a的体积分数由45～55％匀速降低至13～30％；35～35.1min，所述流动相a的体积分数由13～30％匀速增加至93～97％；35.1～45min，所述流动相a的体积分数为93～97％；

10、所述流动相体系的流速为0.8～1.2ml/min；

11、检测波长：300nm；

12、进样量：5～20μl。

13、优选地，所述有关物质包括杂质26、杂质28、杂质55、杂质50、杂质30、杂质32、杂质56、杂质33和杂质36中的一种或几种。

14、优选地，所述缓冲溶液-乙二胺四乙酸二钠混合水溶液包括缓冲盐、酸、乙二胺四乙酸二钠和水。

15、优选地，所述缓冲盐包括磷酸二氢盐和/或醋酸铵；

16、所述缓冲溶液-乙二胺四乙酸二钠混合水溶液中缓冲盐的浓度为0.005～0.03mol/l。

17、优选地，所述磷酸二氢盐包括磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠。

18、优选地，所述酸包括磷酸、盐酸、高氯酸和醋酸中的一种或几种。

19、优选地，所述缓冲溶液-乙二胺四乙酸二钠混合水溶液中乙二胺四乙酸二钠浓度为0.0001～0.002mol/l。

20、优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：

21、洗针液：氨水-甲醇混合溶液。

22、优选地，所述氨水-甲醇混合溶液中氨水与甲醇的体积比为7:3～3:7；

23、所述氨水中氨的体积分数为0.05～1％。

24、优选地，所述采用高效液相色谱对磷酸特地唑胺进行检测过程中，溶液的配制采用的稀释剂为流动相a-乙腈混合溶液，所述流动相a-乙腈混合溶液中流动相a的体积分数为80～90％。

25、本发明提供了一种磷酸特地唑胺中有关物质的检测方法。本发明以ph值为6～7的缓冲溶液-乙二胺四乙酸二钠混合水溶液作为流动相a，以甲醇-乙腈混合溶液(甲醇体积分数为10～30％)作为流动相b，当流动相的ph值大于7时，杂质56呈现双肩峰(两个同分异构体混合物)，不利于积分及结果计算，本发明通过调节流动相a的ph值为6～7，解决了杂质56峰形问题，使得杂质56以单峰形式出锋，方便积分及结果计算；而且，以甲醇-乙腈混合溶液作为流动相b，且控制流动相a的ph值为6～7，在解决磷酸特地唑胺样品溶解性的同时亦保证了符合绝大多数c18柱的ph值耐受范围，提高色谱柱耐用性和使用寿命；流动相b中甲醇的添加调节了流动相的极性，从而改善磷酸特地唑胺与其杂质的保留并提高相互间的分离度。色谱柱及色谱仪管路存在的残余微量金属离子会对杂质28产生金属耦合作用而导致峰形拖尾严重(拖尾因子大于2.5)，且峰展宽检测灵敏度低，本发明通过在流动相a中加入乙二胺四乙酸二钠作为金属螯合剂，对色谱柱和色谱仪管路存在的残余微量金属离子进行络合去除，改善杂质28的峰形尖锐对称，方便积分计算结果并提高该杂质的检测灵敏度，各色谱峰之间能均能达到基线分离，各色谱峰之间的分离度均不低于2.0，能够准确定位和定量测定各已知杂质的含量。本发明通过控制梯度洗脱的程序，能有效的洗脱出弱极性杂质，避免流动相盐析导致色谱柱堵塞或色谱仪管路的堵塞，对色谱柱和色谱仪起到很好的保护作用。如实施例测试结果所示，本发明提供的检测方法，磷酸特地唑胺中有关物质以及各有关物质之间均能达到良好分离，分离度均大于2.0；在经强酸、强碱、氧化、高温、光照降解后的样品图谱中，纯度角均≥99.3％，主峰与相邻杂质间分离度均≥4.9，主峰与相邻杂质分离度良好；各破坏条件下降解样品对未破坏样品的质量平衡均在98.8～100.4％之间；磷酸特地唑胺峰理论塔板数为44372＞5000，说明，本发明提供的检测方法的专属性优异；各有关物质的回收率为99.4～103.5％，rsd≤3.2％，说明，本发明提供的检测方法准确度良好；本发明提供的检测方法中磷酸特地唑胺及各杂质峰形尖锐，定量限浓度为0.048～0.057μg/ml；检测限浓度为0.01～0.012μg/ml；说明，本发明提供的检测方法对各杂质检出能力强，方法灵敏度高。本发明提供的检测方法在相当于供试品浓度的0.01～1.0％的浓度范围内线性关系良好，线性范围宽，检测方法重复性好、准确度高。

26、进一步的，由于磷酸特地唑胺的溶解性存在ph值依赖性，在低ph值难溶解，高ph值易溶解，在水及普通有机试剂中溶解度不高，使用不同比例的甲醇水溶液或乙腈水溶液作为洗针液进行测试时，不同品牌的色谱仪进行连续进样供试品溶液后存在较大的进样残留，进高浓度供试品后进低浓度的对照溶液峰面积增大影响结果计算以及系统稳定性评判，亦会影响后续使用。本发明通过在甲醇水溶液中加入适量的氨水使得洗针液的ph值显弱碱性，增加磷酸特地唑胺的溶解性，提高洗针液的洗净能力，同时氨水为非盐类具有很好的水溶性并有挥发性，不存在盐析残留与进样针表面产生进样针堵塞的问题，在达到进样针洗净效果的同时保证对仪器的保护。

27、进一步地，本发明采用的稀释剂中添加了乙二胺四乙酸二钠(来源于流动相a)，能够将配制溶液采用的量瓶以及检测采用的进样瓶中的微量碱金属络合除去，避免样品被碱化，减少磷酸特地唑胺主成分的水解以及有关物质的降解，提高系统适用性溶液的稳定性放置时间，节约系统适用性对照品的使用量，可有效节约分析成本。