高效液相色谱串联质谱法测定血浆中熊去氧胆酸浓度和消除内源性物质干扰的方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种消除内源性物质干扰后采用高效液相色谱串联质谱法痕量检测sd大鼠血浆中熊去氧胆酸浓度的方法

背景技术：

1、熊去氧胆酸是一种生理性物质，有着利胆、细胞保护、抗氧化和免疫调节的作用，用于肝胆疾病的治疗。熊去氧胆酸的血药浓度检测方法有衍生化hplc-uv法和质谱法，但这些方法操作繁琐，达不到痕量分析要求，本发明建立高效液相色谱串联质谱法来测定sd大鼠血浆中熊去氧胆酸浓度。然而检测过程发现血浆中存在内源性干扰物质，其通常是空白基质里就存在的，会引起准确度、特异性问题，使分析方法变得更复杂，从而导致分析方法的准确度和精密度下降，且因个体间和个体内的基线波动及受药物、疾病、生物调控的影响而难以确定。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种检测血浆中熊去氧胆酸浓度方法，所述方法操作更为简便，且能消除内源性物质的干扰，因此具有更高的灵敏度

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种测定血浆中熊去氧胆酸浓度的方法，包括以下步骤：

3、1.对样品进行除杂提取，包括以下步骤：

4、(1)溶解小檗碱(bbr)及其内标bbr-d6，熊去氧胆酸(udca)，甘氨熊去氧胆酸(gudca),牛磺熊去氧胆酸(tudca)及内标udca-d4的对照品至一定浓度用以配制校正标样和质控样品溶液。

5、(2)对不同来源sd大鼠血浆样品中内源性物质进行干扰分析后，选择干扰小的血浆作为混合基质，并配制校正标样和质控样品。

6、(3)分别取30μl样品、校正标样和质控样品于96孔板中；所述校正标样共有八组分别为(ng/ml):第一组：udca 200/gudca 20.0/tudca 50.0/bbr 0.0500、第二组：udca 400/gudca 40.0/tudca 100/bbr 0.100、第三组：udca 1000/gudca 100/tudca 250/bbr0.250、第四组：udca 2000/gudca 200/tudca500/bbr 0.500、第五组：udca 4000/gudca400/tudca 1000/bbr 1.00、第六组：udca 20000/gudca 2000/tudca 5000/bbr 5.00、第七组：udca 36000/gudca 3600/tudca 9000/bbr 9.00、第八组：udca 40000/gudca 4000/tudca10000/bbr 10.0；

7、所述质控样品为(ng/ml):udca 600/gudca 60.0/tudca 150/bbr 0.150、udca3200/gudca 320/tudca 800/bbr 0.800和/或udca 32000/gudca 3200/tudca 8000/bbr8.00。

8、(4)取30μl空白基质，作为双空白和单空白样品于96孔板中；

9、(5)在双空白样品中加入20μl溶液a，所述溶液a为：水:乙腈＝50:50(v:v)；

10、(6)在其它样品中加入20μl溶液b，所述溶液b为：含有2.00ng/ml bbr-d6和2000ng/ml udca-d4的水溶液:乙腈＝50:50(v:v)；然后所有样品加入250μl乙腈沉淀；

11、(7)将96孔板振摇15min，随后在4℃、3220×g条件下离心15min。

12、(8)分析bbr：从(7)取上清液80μl置于96孔板中，加入80μl纯水溶液稀释，将其振摇10min后，在4℃、3220×g条件下转速离心5min，样品直接进样分析。

13、(9)分析udca,gudca,tudca：从(7)取上清液20μl置于96孔板中，加入280μl溶液a稀释，将其振摇10min后，在4℃、3220×g条件下转速离心5min，样品直接进样。

14、2.使用高效液相色谱分离各分析物，其设备参数如下：

15、(1)分离bbr：

16、设备：沃特世acquity超高效液相色谱系统分析柱：acquitybeh c18 2.1*50mm，1.7μm(沃特世公司)，

17、流动相a：含0.1％甲酸和2mmol/l乙酸铵的水:乙腈(v:v,95:5)的溶液，

18、流动相b：含0.1％甲酸和2mmol/l乙酸铵的水:乙腈(v:v,5:95)的溶液，

19、弱洗：含10％的乙腈水溶液，

20、强洗：水:甲醇:乙腈:异丙醇(v:v:v:v,1:1:1:1)溶液，

21、进样体积：5μl(进样体积可适当调整，以便得到良好的质谱行为)，

22、进样器温度：15℃，柱温：45℃，运行时间：1.80min；洗脱梯度如表1：

23、

24、

25、表1

26、(2)分离udca,gudca,tudca：

27、设备：岛津lc-30ad超高效液相色谱系统，

28、分析柱：acquityhss t3,2.1*50mm，1.8μm(沃特世公司)，

29、流动相a：含0.1％甲酸和1mmol/l乙酸铵的水：乙腈(v:v,95:5)溶液，

30、流动相b：含0.1％甲酸和1mmol/l乙酸铵的水：乙腈(v:v,5:95)溶液，

31、洗液：水:甲醇:乙腈:异丙醇(v:v:v:v,1:1:1:1)溶液，

32、进样体积：5μl(进样体积可适当调整，以便得到良好的质谱行为)，进样器温度：15℃，柱温箱温度:40℃，运行时间：4.00min，洗脱梯度如表2：

33、

34、表2

35、3.使用质谱检测各分析物，其设备参数如下：

36、(1)检测bbr：

37、质谱型号：ab sciex triple quad 6500+

38、扫描模式：多反应离子监测(正离子模式)如表3：

39、

40、表3

41、多反应监测参数如表4:

42、

43、表4

44、(2)检测udca,gudca,tudca：

45、质谱型号：ab sciex api 5000，

46、扫描模式：多反应离子监测(负离子模式)如表5：

47、

48、表5

49、多反应监测参数如表6：

50、

51、表6

52、校正曲线以1/x2为加权系数，将分析物与内标的峰面积的比值和校正标样中分析物的理论浓度来进行线性回归。sd大鼠血浆样本中分析物浓度的计算公式如下，将样品测得的分析物与内标峰面积比值代入即可获得分析物的浓度。

53、y＝ax+b

54、x＝分析物浓度(ng/ml)

55、y＝分析物与内标峰面积比值

56、a＝回归曲线的斜率

57、b＝回归曲线y轴的截距

58、本发明具有如下优点：因熊去氧胆酸的结构没有紫外吸收的发光基团，而hplc-uv法只能通过末端紫外吸收，通常的定量下限只能达到μg级，国外报道衍生化后用此方法检测的操作步骤复杂，且一个样品检测时长达25分钟。本发明通过对不同来源的sd大鼠血浆筛选排除内源性物质干扰，以乙腈作为蛋白沉淀剂，在前处理过程中去除大部分杂质，操作简单；高效液相色谱进一步纯化，使各分析物在色谱柱上合理保留并被洗脱，质谱检测出峰时间短，大大提高了样品分析的准确性和灵敏度，达到痕量分析要求。