一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒与流程

本发明属于血型检测领域，具体涉及一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

1、红细胞血型是根据血液中红细胞膜表面抗原来划分的，根据抗原种类的不同，可以划分出20多个常见的分类系统，其中包括abo血型系统和rh血型系统。正确的血型鉴定对输血至关重要，输入不相容的血型会导致溶血的发生，进而导致严重的医疗事故。因此，快速、准确、操作简便的血型鉴定方法可为抢救危急病人、应对突发事件提供保障。

2、目前血型鉴定主要分为凝集法和基因法两大类。凝集法的原理为检测血液中红细胞(rbc)表面抗原，只要rbc表面存在相应抗原，即可与相应抗体发生凝集反应，包括纸片法、试管法、微柱法等。其优点是检测速度快，但受抗体保存条件限制，不适用于野外紧急条件，且通常误差较大。基因法主要通过特异性引物对rbc基因进行分型，以此对各自血型进行鉴定，尤其适合复杂血型的鉴定。但其检测速度慢、操作不便、成本高。因此，依然有必要开发操作简便、检测速度快，检测结果准确的血型检测工具。

3、目前主流的是利用迁移层析法检测人血型的试剂卡，其通常采用胶体金系统进行显色，一般都需要在试剂卡上专门设置含有胶体金标记抗体的结合垫使检测样本中的a血型抗原或b血型抗原先与胶体金标记抗体完成特异性结合，然后再通过检测线和质控线的显色情况进行结果判读。此类试剂卡在制备过程中由于引入胶体金和微球标记的蛋白，使得操作步骤繁琐，且引入胶体金和微球后，使反应物更加复杂。此外，此类试剂卡只能单侧加样，而且对结合垫的要求较高(血型抗原和胶体金的结合情况直接影响检测结果)，因此结果判读时间较长，一般为加样后15-30min。另外，这类试剂卡需依据检测线和质控线处胶体金显色进行结果判读，但由于检测样本(全血或者红细胞悬液)中所含有的血红蛋白本身就有颜色，因此有可能会在结果判读时呈现肉眼可见的颜色干扰，进而影响检测结果的准确性和精读。

4、虽然现有技术中也有尝试通过红细胞凝集直接显色的技术方案，但目前只能做到用单一抗体来检测未知血型。例如，中国发明专利申请cn101603967b公开了一种快速检测人abo/rh/mn血型的方法及试剂盒，该专利通过判断血液与单一抗体在玻璃纤维上是否有发生凝集反应的红细胞残留来判断血型，每次只能用一种已知抗体来检测未知血型，如果要检测多种血型抗原就要增设多张彼此独立的试纸检测条，分别加样检测，导致检测效率低，多次加样导致样本整体用量大，检测卡消耗严重等问题。并且检测的精度也容易因不同试纸条之间的差异和多次加样时存在的操作差异而受到影响。

5、综上所述，有必要针对现有的红细胞抗原检测方法做出优化和改进。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒。具体技术方案如下。

2、一种红细胞抗原检测方法，包括如下步骤：

3、步骤1)：准备一张硝酸纤维素膜并在其上设置显色线，将红细胞抗体用抗体包被液稀释100-200倍后包被到所述显色线上并进行风干，所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的bsa、0.1％-0.3％的proclin 300和pbs缓冲液，所述显色线之间平行排列，相邻显色线之间的间距为3-5mm；

4、步骤2)：将20μl-30μl待检测的含红细胞的全血或红细胞悬浮液滴加到步骤1)所述的显色线中间，利用毛细扩散的作用使所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液与显色线上包被的红细胞抗体结合并反应，所述硝酸纤维素膜的毛细爬速为65-75s/4cm；

5、步骤3)：再滴加100-150μl冲洗液到所述硝酸纤维素膜上，促进所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液在所述硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走(使检测背景干净，便于结果判读)，所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的tween-80、0.1％-0.3％的proclin 300和pbs缓冲液。

6、进一步，所述显色线包括检测线和质控线，包被的红细胞抗体包括抗a单克隆抗体，抗b单克隆抗体，抗rhd抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体(rbc抗体)。分别对应制成检测线a线、b线、d线和质控线c线。

7、进一步，所述红细胞抗体的起始浓度为2.0-3.0mg/ml。

8、优选的，所述硝酸纤维素膜的毛细爬速为70s/4cm。

9、进一步，步骤1)中所述的硝酸纤维素膜上包被好抗体后于30-37℃条件下风干8-16h。

10、优选的，所述pbs缓冲液的浓度为0.01m。

11、一种红细胞抗原检测试剂盒，所述红细胞抗原检测试剂盒包括含有血型抗原检测试纸条的试剂卡、红细胞抗体、抗体包被液和冲洗液；所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的bsa、0.1％-0.3％的proclin 300和pbs缓冲液；所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的tween-80、0.1％-0.3％的proclin 300和pbs缓冲液。

12、优选的，所述pbs缓冲液的浓度为0.01m。

13、进一步，所述血型抗原检测试纸条包括硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水纸基两部分，所述吸水纸基边缘压在所述硝酸纤维素膜边缘上。

14、进一步，所述红细胞抗体包括抗a单克隆抗体，抗b单克隆抗体，抗rhd抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体；所述红细胞抗体的浓度为2.0-3.0mg/ml。

15、进一步，所述硝酸纤维素膜上设置有显色线并在其上包被所述红细胞抗体，所述显色线之间平行排列，相邻显色线之间的间距为3-5mm。可以理解的是，所述硝酸纤维素膜下方设置有样品垫，所述样品垫和所述吸水纸基设置在背衬上。

16、可以理解的是，所述血型抗原检测试纸条放置在外壳内，所述外壳上设置观察窗口，所述观察窗口用于显示所述显色线和加样位置；所述外壳上的端部还设置有缓冲液孔。可以理解的是，所述端部可以是检测卡外壳的上端部，也可以是检测卡外壳的下端部。所述观察窗口的长度可以是15mm、16mm、17mm、18mm或19mm。

17、进一步，所述吸水纸基厚度大于等于0.6mm，长度大于等于10mm；所述硝酸纤维素膜长度为25mm，毛细爬速为65-75s/4cm。

18、有益技术效果

19、1)本发明提供了一种红细胞抗原检测方法，具体来说，以硝酸纤维素膜(nc膜)为检测载体，通过优化包被到所述硝酸纤维素膜上的红细胞抗体浓度、稀释所述红细胞抗体的抗体包被液成分、冲洗检测样品的冲洗液成分以及所述硝酸纤维素膜上的显色线设置等，提供了一种以有生物活性的红细胞直接作为阴阳性指示系统(即包被在检测线和质控线上的抗体直接与红细胞抗原结合)，无需介入胶体金、微球等非生物活性指示系统进行指示，实现了对血液里的不同抗原进行同时检测的方法。本发明方法还通过吸水纸基的长度及厚度、硝酸纤维素膜毛细爬速和加样位置的优化，提高了检测的准确率，减少了假阳性和假阴性出现的概率，同时操作简单、灵敏度高。在简化血型检测方式、缩短血型检测时间的同时实现了在同一张试纸条上对血液里的不同血型抗原的同时检测，提高了血型检测的精度和效率。

20、2)本发明提供的红细胞抗原检测方法利用毛细作用均匀分布的原理，将加样位置设置在nc膜几条显色线中间，再辅以冲洗液促进待测样本在nc膜上均匀扩散，使得红细胞样本一经扩散就能快速跟显色线上包被的抗体发生结合反应，极大的缩短了结果判读的时间；此外冲洗液还能冲走未反应的红细胞，使背景更加干净。利用本发明的红细胞抗原检测方法或试剂盒进行检测，结果判读的时间为加样5min后。而传统检测卡利用虹吸作用加样位置一般在检测卡一侧的尽头，加入的全血或红细胞悬液需依次爬行到试纸条不同检测线位置再与分别检测线上包被的抗体发生结合反应，因此判读时间一般为加样后15-30min。此外，本发明方法还能做到仅需检测一次，就能对未知血液样品里的abo抗原和rhd抗原进行同时检测，节约了血液样品和试剂卡的用量。

21、3)本发明还提供的稀释红细胞抗体的抗体包被液可以牢固地将抗体固定在nc膜上，此外还能保护抗体，使抗体的稳定性提高，进而提高了检测方法的准确性，同时还能使制得的血型检测试剂卡存放时间更长而不至于使其包被的抗体变性失活。

22、4)本发明提供的红细胞抗原检测方法由于采用了特别的抗体包被液和冲洗液协同配合，使得待测样品能够均匀扩散且与检测线上包被的抗体在短时间内就能紧密结合，因此需要的样品加样量少，仅需20μl或30μl样品就能实现abo血型和rhd血型的同时检测，节约了样本量。传统检测卡由于采用虹吸作用原理，需要足够的样本量才能使样本爬行到最远处的检测线并与此结合，因此需要的加样量一般需要大于60μl。