一种高稳定性磁珠的制备方法与流程

1.本发明涉及免疫化学检测技术领域，尤其涉及一种高稳定性磁珠的制备方法。


背景技术：

2.磁微粒一般指尺寸在微米及纳米级的球形复合物，是通过适当的方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。其最为突出的特点是具有超顺磁性，能够被外加磁场磁化，撤去外加磁场后，磁性同时消失。这一特性使磁性微纳米材料具有能够在外加磁场作用下运动聚集，同时在去掉外加磁场后又重新分散的能力，成为一种接近完美的生物分离载体。
3.磁微粒的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家johnugelstad，他在1976年以聚苯乙烯为主要材料，制造出均匀磁化的球体粒子。目前科学家们不仅可以精准控制磁珠的粒径大小，开发1-100μm粒径大小的磁珠，而且磁珠表面官能团种类也丰富很多，广泛用于细胞分离，核酸提取，生物医药的靶点鉴定及代谢性质研究和蛋白纯化与免疫分析。
4.目前磁微粒在体外诊断的各个技术领域也被广泛应用。如磁微粒化学发光免疫分析技术(clia)。clia用的磁珠粒径在1-3μm左右，磁珠制备技术成熟且比较知名的磁珠厂家有德国merck，日本jsr，美国dynabeads等。clia对磁珠的性能基本要求如下：磁响应速度快，含磁量高；分散性好、沉降速度慢；化学稳定性高，非特异性吸附低，信噪比高；基团含量高，键合力强，灵敏度高。
5.磁微粒根据表面官能团的不同可以分为羧基磁珠，甲苯磺酰基磁珠，氨基磁珠，环氧基磁珠，链酶亲和素磁珠(sa-mb)等。其中甲苯磺酰基磁珠由于其在偶联抗体过程中无需加入活化剂，操作简单方便，工艺批间差可控，且工艺易放大而被广泛应用于体外诊断领域用来标记抗原抗体。但甲苯磺酰基磁珠的疏水性比较强，在偶联蛋白的同时会有一部分蛋白以物理吸附的形式固定到磁珠上，随着时间的延长，这部分物理吸附的蛋白会发生脱落，对磁珠的长期稳定性造成影响，进而影响试剂的加速稳定性和长期稳定性(图1)。目前人们常用在高温37-45℃的条件下多次清洗的方法来除去磁珠表面物理吸附不牢固的蛋白，但这种去除方式耗时长，且存在清洗不彻底的问题。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何降低磁珠表面对蛋白的物理吸附作用以及增强物理吸附蛋白与磁珠的连接，提高磁珠的稳定性。
7.为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种高稳定性磁珠，所述高稳定性磁珠具有如下结构，
[0009][0010]
所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体，所述抗体与磁珠通过氨基
化学反应或物理吸附连接，所述抗体与抗体之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。
[0011]
进一步地，本发明提供的所述高稳定性磁珠具有如下结构，
[0012][0013]
所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠，所述磁珠表面偶联抗体和惰性蛋白，所述抗体与磁珠通过氨基化学反应或物理吸附连接，所述惰性蛋白与磁珠通过氨基化学反应连接，所述抗体与抗体之间、抗体与惰性蛋白之间通过交联剂连接，所述交联剂为双官能团交联剂。
[0014]
进一步地，所述双官能交联剂选自戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯、琥珀酰亚胺基辛二酸酯、庚二亚氨酸二甲酯或双官能peg。
[0015]
进一步地，所述惰性蛋白选自bsa或酪蛋白。
[0016]
术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体、单克隆抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；单链抗体分子；scfv、sc(fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0017]
第二方面，本发明提供一种制备高稳定性磁珠的溶液，包括甲苯磺酰基磁珠、抗体和双官能交联剂。
[0018]
本发明利用甲苯磺酰基磁珠表面的磺酰基与抗体上的氨基发生化学反应进行化学键连接，不需要额外的抗体偶联工艺，大部分抗体通过化学键连接在磁珠表面，连接稳定，不易发生脱落。
[0019]
进一步地，所述溶液还包括惰性蛋白。
[0020]
所述惰性蛋白能够结合磁珠表面多余位点，从而减少磁珠表面对抗体的物理吸附同时起到稳定抗体构象的作用，提高磁珠自身的稳定性。
[0021]
进一步地，所述惰性蛋白选自bsa或酪蛋白。
[0022]
进一步地，所述双官能交联剂选自戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯(bs3)、琥珀酰亚胺基辛二酸酯(dss)、庚二亚氨酸二甲酯(dmp)或双官能peg。
[0023]
进一步地，所述溶液还包括缓冲液。
[0024]
另一方面，本发明提供了一种高稳定性磁珠的制备方法，包括以下步骤：
[0025]
s1、清洗磁珠；
[0026]
s2、将抗体投入清洗好的磁珠中，进行偶联；
[0027]
s3、在s2步骤偶联后的磁珠中加入双官能团交联剂，进行交联。
[0028]
进一步地，所述步骤s2中还包括，将惰性蛋白投入清洗好的磁珠中，进行偶联。
[0029]
进一步地，本发明提供的制备方法中，步骤s1的具体方法包括：向磁珠原液中加入硼酸缓冲液，震荡混匀，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述洗涤过程2-5次；
[0030]
进一步地，本发明提供的制备方法中，步骤s2的具体方法包括：将清洗好的磁珠加入所述的硼酸缓冲液重悬，向其中投入抗体进行偶联；
[0031]
进一步地，本发明提供的制备方法中，步骤s3的具体方法包括：将偶联后的磁珠溶液用交联缓冲液清洗2-5次，再用交联缓冲液重悬；随后向溶液中加入双官能团交联剂溶液，震荡混匀，进行交联；
[0032]
进一步地，本发明提供的制备方法中，交联完成之后还包括封闭的步骤，具体操作为：交联反应结束后加入封闭缓冲液清洗，然后重悬，在37℃恒温条件下封闭18-28h，封闭结束后用保存缓冲液进行保存，得到偶联抗体的磁珠。
[0033]
进一步地，所述双官能团交联剂溶液是将双官能团交联剂用dmso或水溶解后配成，浓度为5-20mg/ml。
[0034]
进一步地，所述交联缓冲液包含100mm tea，100mmnacl，ph8.0；
[0035]
所述封闭缓冲液包含10mm tris，0.5％bsa，ph7.4；
[0036]
保存缓冲液包含10mm pbs，5％蔗糖，0.5％bsa，ph7.0。
[0037]
在一实施例中制备方法具体如下：
[0038]
s1、清洗磁珠；
[0039]
需要说明的是，磁珠原液中包含磁珠和保存液，在偶联时需要确定磁珠的用量。本实施例中，以需要偶联的甲苯磺酰基磁珠的质量定为amg,磁珠原液的浓度为b mg/ml，则量取的磁珠原液的体积c ml＝amg
÷
b mg/ml；
[0040]
准确量取c ml体积的甲苯磺酰基磁珠浓缩液放入容器内，加入体积为d＝(a
÷
20)ml的第一包被缓冲液，震荡混匀后，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述过程，洗涤，得到清洗完成的磁珠。
[0041]
其中，第一包被缓冲液：包含100mm的硼酸，ph9.5；
[0042]
s2、将抗体投入清洗好的磁珠中，进行偶联；
[0043]
将上述清洗好的磁珠用第一包被缓冲液重悬，然后投入0.02amg的抗体和0.02amg的惰性蛋白，加入1/3d ml的第二包被液，使最终溶液的总体积为dml，迅速震荡混匀，在37℃恒温箱内边混匀边进行偶联反应20h。
[0044]
本实施例所使用的惰性蛋白是bsa。
[0045]
第二包被缓冲液：包含100mm硼酸，3m硫酸铵，ph9.5。
[0046]
s3、在s2步骤偶联后的磁珠中加入双官能团交联剂，进行交联。称量一定质量的双端官能团交联剂，用dmso进行溶解，得到浓度为10mg/ml双端官能团交联剂溶液。
[0047]
将偶联后的磁珠溶液用交联缓冲液清洗3次，再用交联缓冲液重悬，随后向溶液中加入0.002aml的双端官能团交联剂溶液震荡混匀，在37℃恒温条件下进行交联反应2h。
[0048]
s4.封闭
[0049]
交联反应结束后，向交联好的磁珠中加入d ml的封闭缓冲液清洗，清洗结束后加入d ml的封闭缓冲液重悬，在37℃恒温条件下封闭18-28h，封闭结束后用保存液清洗，洗涤完毕后加入d ml保存缓冲液进行保存，得到偶联抗体的甲苯磺酰基磁珠。
[0050]
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
[0051]
本发明通过利用双端官能团交联剂和惰性蛋白将要修饰的抗体偶联在磁珠上，惰性蛋白的偶联能够减少抗体对磁珠表面的物理吸附，对于物理吸附的抗体，双官能团交联剂能够将其通过与共价连接的抗体共同交联并固定在磁珠上，最终起到提高磁珠稳定性的作用。
[0052]
本发明提供的高稳定性磁珠的制备方法是基于双端官能团交联剂和惰性蛋白偶联的获得含抗体磁珠的方法，通过将物理吸附的蛋白与共价连接的蛋白交联，使抗体尽可能多的连接并固定在磁珠上，从而提高磁珠的稳定性。与常规工艺得到的磁珠相比，本发明的方法能显著提高磁珠的稳定性，减少抗体的脱落，且操作简单，省时。
附图说明
[0053]
图1为现有技术中，甲苯磺酰基磁珠稳定性差的原理示意图。
具体实施方式
[0054]
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，附图中类似的组件标号代表类似的组件。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0055]
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
[0056]
还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
[0057]
实施例1
[0058]
本发明实施例提供一种高稳定性磁珠的制备方法，此方法适用所有偶联蛋白的甲苯磺酰基磁珠，本实施例以修饰了ipth抗体的甲苯磺酰基磁珠为例，具体操作介绍如下：
[0059]
s1、磁珠的清洗
[0060]
需要说明的是，磁珠原液中包含磁珠和保存液，在偶联时需要确定磁珠的用量。本实施例中，以需要偶联的甲苯磺酰基磁珠的质量定为20mg,磁珠原液的浓度为100mg/ml，则量取的磁珠原液的体积0.2ml；
[0061]
准确量取0.2ml体积的甲苯磺酰基磁珠浓缩液放入容器内，加入体积为1ml的第一包被缓冲液，震荡混匀后，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述过程，共洗涤3次，得到清洗完成的磁珠。
[0062]
s2.磁珠的偶联
[0063]
将上述清洗好的磁珠用第一包被缓冲液重悬，然后投入0.4mg的ipth抗体和0.4mg的惰性蛋白，加入0.3ml的第二包被液，使最终溶液的总体积为1ml，迅速震荡混匀，在37℃恒温箱内边混匀边进行偶联反应20h。
[0064]
本实施例所使用的惰性蛋白是bsa。
[0065]
s3.磁珠的交联
[0066]
称量一定质量的双端官能团交联剂dss，用dmso进行溶解，得到浓度为10mg/ml双端官能团交联剂溶液。
[0067]
将偶联后的磁珠溶液用交联缓冲液清洗3次，再用交联缓冲液重悬，随后向溶液中
加入0.04ml的双端官能团交联剂溶液震荡混匀，在37℃恒温条件下进行交联反应2h。
[0068]
s4.封闭
[0069]
交联反应结束后，向交联好的磁珠中加入1ml的封闭缓冲液清洗3次，清洗结束后加入1ml的封闭缓冲液重悬，在37℃恒温条件下封闭18-28h，封闭结束后用保存液清洗3次，洗涤完毕后加入1ml保存缓冲液进行保存，得到偶联ipth抗体的甲苯磺酰基磁珠。
[0070]
本发明实施例中，所用试剂的具体成份如下：
[0071]
第一包被缓冲液：包含100mm的硼酸，ph9.5；
[0072]
第二包被缓冲液：包含100mm硼酸，3m硫酸铵，ph9.5。
[0073]
交联缓冲液：包含100mm tea，100mm nacl，ph8.0；
[0074]
封闭缓冲液：包含10mm tris，0.5％bsa，ph7.4；
[0075]
保存缓冲液：包含10mm pbs，5％蔗糖，0.5％bsa，ph7.0。
[0076]
对比例1
[0077]
采用常规工艺制备ipth甲苯磺酰基磁珠：
[0078]
s1、磁珠的清洗
[0079]
准确量取0.2ml体积的甲苯磺酰基磁珠浓缩液放入容器内，加入体积为1ml的第一包被缓冲液，震荡混匀后，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述过程，共洗涤3次，得到清洗完成的磁珠。
[0080]
s2.磁珠的偶联
[0081]
将上述清洗好的磁珠用第一包被缓冲液重悬，然后投入0.2mg的ipth抗体，加入0.3ml的第二包被液，使最终溶液的总体积为1ml，迅速震荡混匀，在37℃恒温箱内边混匀边进行偶联反应20h。
[0082]
s3.封闭
[0083]
偶联反应结束后，向磁珠中加入1ml的封闭缓冲液清洗3次，清洗结束后加入1ml的封闭缓冲液重悬，在37℃恒温条件下封闭18-28h，封闭结束后用保存液清洗3次，洗涤完毕后加入1ml保存缓冲液进行保存，得到偶联ipth抗体的甲苯磺酰基磁珠。
[0084]
对比例2
[0085]
只加入惰性蛋白不加入双官能团交联剂制备的ipth甲苯磺酰基磁珠：
[0086]
s1、磁珠的清洗
[0087]
准确量取0.2ml体积的甲苯磺酰基磁珠浓缩液放入容器内，加入体积为1ml的第一包被缓冲液，震荡混匀后，磁吸附一段时间后弃去上清，重复上述过程，共洗涤3次，得到清洗完成的磁珠。
[0088]
s2.磁珠的偶联
[0089]
将上述清洗好的磁珠用第一包被缓冲液重悬，然后投入0.4mg的ipth抗体和0.4mg的惰性蛋白，加入0.3ml的第二包被液，使最终溶液的总体积为1ml，迅速震荡混匀，在37℃恒温箱内边混匀边进行偶联反应20h。
[0090]
s3.封闭
[0091]
偶联反应结束后，向磁珠中加入1ml的封闭缓冲液清洗3次，清洗结束后加入1ml的封闭缓冲液重悬，在37℃恒温条件下封闭18-28h，封闭结束后用保存液清洗3次，洗涤完毕后加入1ml保存缓冲液进行保存，得到偶联ipth抗体的甲苯磺酰基磁珠。
[0092]
选取多个实施例1和对比例1-2得到的ipth甲苯磺酰基磁珠样本，分别测试其在37℃加速7天、以及在2-8℃放置一年后的光值，测试结果如表1-6。
[0093]
表1.对比例1得到的ipth甲苯磺酰基磁珠在37℃加速前后的各样本光值
[0094]
样本初始值第七天降幅a78485530-29.54％b4652032871-29.34％c274523198425-27.72％d1348450965220-28.42％e57949894186300-27.76％f99971227014980-29.83％g130337469496387-27.14％
[0095]
表2.对比例1得到的ipth甲苯磺酰基磁珠2-8℃放置一年后的各样本光值
[0096][0097][0098]
表3.对比例2得到的ipth在37℃加速前后的各样本光值
[0099]
样本初始值第七天降幅a88497146-19.24％b4663038171-18.14％c269525223652-17.02％d13784851150759-16.52％e58019904881794-15.86％f98991928342049-15.73％g1313574810897417-17.04％
[0100]
表4.对比例2得到的ipth甲苯磺酰基磁珠2-8℃放置一年后的各样本光值
[0101]
样本4℃初始值4℃放置一年降幅a79596367-20.00％b4708939079-17.01％c274026230127-16.02％d13709971160960-15.32％e58049984812924-17.09％
f102143258711798-14.71％g1335775411535756-13.64％
[0102]
表5.实施例1得到的ipth甲苯磺酰基磁珠在37℃加速前后各样本光值
[0103][0104][0105]
表6.实施例1得到的ipth磁珠在2-8℃放置一年后各样本光值
[0106]
样本4℃初始值4℃放置一年降幅a78457744-1.29％b4583745333-1.10％c249909243486-2.57％d134976913669111.27％e564486857233321.39％f99317869746062-1.87％g1173935811469353-2.30％
[0107]
根据表1-6的结果可知，对比例1采用常规偶联工艺得到的磁珠在37℃加速前后光值降幅在20-30％，在4℃条件下放置一年的磁珠光值降幅也在20-30％。加入惰性蛋白后磁珠在37℃加速前后光值降幅在10-20％，在4℃条件下放置一年的磁珠光值降幅也在10-20％，可知加入惰性蛋白能增加磁珠的稳定性，但是仍达不到较好的结果。而本发明的方案，通过对磁珠加入惰性蛋白偶联和交联剂进行交联之后，得到的磁珠在37℃加速前后和4℃放置一年后的各样本光值均在10％以内。显然，本发明方法得到的磁珠，稳定性显著提高。
[0108]
以上结果均说明本发明提供的方法能显著提高偶联ipth抗体的甲苯磺酰基磁珠的稳定性。
[0109]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
[0110]
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。