抗链霉亲和素抗体检测试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明属于体外诊断试剂，尤其是涉及抗链霉亲和素抗体检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

1、生物素-链霉亲和素系统因其具备高亲和力等诸多优势而在免疫分析试剂的开发中被广泛应用，生物素可以显著干扰某些实验室测试并引起不正确的测试结果，如果未识别到干扰，可能会导致患者误诊和/或不适当的干预措施。

2、而近年来，生物素-链霉亲和素系统中的另一个新的干扰因素抗链霉亲和素抗体anti-streptavidin antibodies(asa)同样会显著干扰某些实验室测试并引起不正确的测试结果。与生物素干扰相比，目前对asa干扰的研究要少很多。2013年，nichole等人首次发表了关于干扰临床实验室检测的内源性抗链霉亲和素抗体(asa)的研究报告，指出asa干扰导致患者的tsh检测结果异常偏低，louise k.dahll等人在2021年的一份研究报告中指出，asa引起的干扰比最初认为的更为普遍。nick verougstraete等研究证实样本中产生干扰的抗链霉亲和素抗体(asa)主要是igm型抗体，并推测正常人中抗链霉亲和素抗体(asa)阳性率约为0.01％。

3、目前国外文献中，检测asa抗体的方法主要是通过提取干扰样本中的asa抗体后，再进一步对提取物进行检测和验证，例如用连接有链霉亲和素的琼脂糖处理干扰样本后重新检测，如样本检测结果正常则间接证明样本中的干扰物质为asa抗体；nickverougstraete等人则是将链霉亲和素固定在sds聚丙烯酰胺凝胶泳道上，通过sds凝胶电泳将样本中的asa抗体分离出来后通过免疫印迹的方法进行干扰物质的确认。

4、以上方法检测asa抗体耗时长，操作复杂，通量小。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种灵敏度高、特异性好、操作简单且高通量的抗链霉亲和素抗体(asa)的检测试剂盒、检测方法及应用，用于检测待测样本中是否存在asa对检测结果产生干扰以及产生干扰的程度。

2、本发明第一方面提供了抗链霉亲和素抗体检测试剂盒，包括；第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包含链霉亲和素包被的固相载体；所述第二试剂包含可检测标记物标记的链霉亲和素。

3、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物标记的链霉亲和素包括可检测标记物标记的链霉亲和素单体和可检测标记物标记的多聚链霉亲和素。

4、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物标记的链霉亲和素单体浓度为0.1-0.5μg/ml，和/或，所述可检测标记物标记的多聚链霉亲和素浓度为0.1-0.5ng/ml。

5、本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包括抗链霉亲和素抗体校准品和分析缓冲液。

6、本发明的一些实施例中，所述抗链霉亲和素抗体校准品包括抗链霉亲和素抗体阳性校准品和/或抗链霉亲和素抗体阴性校准品。

7、本发明的一些实施例中，所述抗链霉亲和素抗体阳性校准品中包括抗链霉亲和素抗体。

8、本发明的一些实施例中，所述抗链霉亲和素抗体阳性校准品中抗链霉亲和素抗体的浓度为0-200μg/l。

9、本发明的一些实施例中，所述校准品即校准物质，指在校准函数中用作独立变量值的参考物质，在体外诊断临床检测中起到检测和监督检验结果具有准确性和一致性的作用。

10、本发明的一些实施例中，所述分析缓冲液包括缓冲体系、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和无机盐。

11、本发明的一些实施例中，所述缓冲体系包括磷酸盐缓冲体系、tris缓冲体系、mes缓冲体系、hepes缓冲体系中的至少一种。

12、本发明的一些实施例中，所述稳定剂包括葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、海藻糖、果糖、蔗糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、甘露醇、丙三醇中的至少一种。

13、本发明的一些实施例中，所述表面活性剂有助于使抗原稳定分散在缓冲体系中。本发明没有特别的限制，可以使用诊断试剂领域中任何常见的表面活性剂。

14、本发明的一些实施例中，所述表面活性剂包括tween、span、triton、emulgen系列表面活性剂中的至少一种。例如：吐温20、吐温40、曲拉通100。

15、本发明的一些实施例中，所述表面活性剂包括月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3aramt1、sho62c和am phitol中的至少一种。

16、本发明的一些实施例中，所述防腐剂的种类，本发明没有特别的限制，可以使用诊断试剂领域中任何常见的防腐剂。

17、本发明的一些实施例中，所述防腐剂包括叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、二甲苯酚、尼泊金酯、高锰酸盐、抗生素类、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠、咪唑烷基脲中的至少一种。

18、本发明的一些实施例中，所述抗生素类防腐剂包括庆大霉素、二氯乙酰胺或supelco公司的proclin系列。

19、本发明的一些实施例中，所述无机盐在本发明的分析缓冲液中作用为提供电解质。

20、本发明的一些实施例中，所述无机盐包括钠盐、钾盐中的至少一种；例如：氯化钠。

21、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物是指一类可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学等手段进行检测的物质。

22、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物包括酶、荧光染料、放射性标记物、化学发光物质、生物发光物质中的至少一种。

23、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物为化学发光物质。

24、本发明的一些实施例中，所述化学发光物质是指一类经催化剂的催化和/或氧化剂的氧化，形成一激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子的物质。

25、本发明的一些实施例中，所述化学发光物质包括吖啶类化学发光物质。

26、本发明的一些实施例中，所述吖啶类化学发光物质适用于化学发光免疫分析系统；在碱性h2o2溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为co2和电子激发态的n-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出光子。

27、本发明的一些实施例中，所述吖啶类化学发光物质包括吖啶酯及其衍生物、吖啶磺酰胺化学发光物质、光泽精中的至少一种。

28、本发明的一些实施例中，所述固相载体包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、乳胶、脂质体、明胶、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、陶瓷或磁性体材质形成的珠粒、微子、板、试管、棒、膜或试验片形状的固相载体。

29、本发明的一些实施例中，所述固相载体包括磁微粒。

30、本发明的一些实施例中，所述链霉亲和素包被的固相载体的制备方法包括：将固相载体与链霉亲和素混合包被反应。

31、根据本发明，所述链霉亲和素包被的固相载体的制备方法具体包括：将活化的羧基磁微粒与链霉亲和素溶液混合，包被反应3-16h，反应结束后将制备好的链霉亲和素包被的磁微粒稀释至0.2-0.5mg/ml，2-8℃保存。

32、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物标记的链霉亲和素的制备方法包括：将链霉亲和素与可检测标记物混合反应。

33、根据本发明，所述可检测标记物标记的链霉亲和素的制备方法具体包括：将可检测标记物分别与链霉亲和素单体和多聚链霉亲和素混合反应0.5-2h，加入终止缓冲液，将可检测标记物标记的链霉亲和素单体稀释至0.1-0.5μg/ml，可检测标记物标记的多聚链霉亲和素稀释至0.1-0.5ng/ml。制备好的可检测标记物标记的链霉亲和素在2-8℃下保存。抗链霉亲和素抗体会对检测结果产生正干扰或者负干扰，如果只采用可检测标记物标记的链霉亲和素单体会使产生负干扰样本的检测灵敏度很低，如果只采用可检测标记物标记的多聚链霉亲和素会使产生正干扰样本的检测灵敏度很低，因此，本发明采用相应浓度比例配合的可检测标记物标记的链霉亲和素单体和可检测标记物标记的多聚链霉亲和素，可以同时保证产生负干扰样本和正干扰样本的检测灵敏度均很高。

34、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物标记的链霉亲和素单体为吖啶酯-链霉亲和素单体。

35、本发明的一些实施例中，所述可检测标记物标记的多聚链霉亲和素为吖啶酯-多聚链霉亲和素。

36、本发明第二方面提供了不以疾病诊断为目的的用于检测抗链霉亲和素抗体的检测方法，采用如第一方面所述的试剂盒检测待测样品中是否存在抗链霉亲和素抗体和/或确定抗链霉亲和素抗体的含量。

37、本发明的一些实施例中，所述检测方法具体包括以下步骤：

38、s1：将20-100μl待测样品和20-100μl包含链霉亲和素包被的固相载体的第一试剂混合；37℃孵育10-20min，洗涤；

39、s2：加入20-100μl分析缓冲液和20-100μl包含可检测标记物标记的链霉亲和素的第二试剂；37℃孵育10-20min，洗涤；

40、s3：加入发光底物液，测定发光信号值强度。

41、本发明的一些实施例中，所述检测方法还包括：将抗链霉亲和素抗体标准品稀释成已知抗链霉亲和素抗体浓度的系列标准品溶液，各浓度加入量为20-100μl，测定系列标准品溶液各浓度的发光信号值强度；以已知抗链霉亲和素抗体浓度的系列标准品溶液的标准浓度为横坐标、发光信号值为纵坐标绘制标准曲线。

42、本发明的一些实施例中，所述已知抗链霉亲和素抗体浓度的系列标准品溶液的标准浓度包括20ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、3550ng/ml、7100ng/ml。

43、本发明的一些实施例中，使用如第一方面所述的试剂盒来判断待测样品中是否存在抗链霉亲和素抗体的的标准为：当待测样品中抗链霉亲和素抗体的浓度≥32ng/ml判定为阳性，当待测样品中抗链霉亲和素抗体的浓度＜32ng/ml判定为阴性。

44、本发明第三方面提供了一种如第一方面所述的试剂盒或如第二方面所述的检测方法在检测抗链霉亲和素抗体中的应用。

45、本发明第四方面提供了一种减少抗链霉亲和素抗体干扰的方法，在干扰样本中加入抗链霉亲和素抗体阻断剂；或，将干扰样本进行稀释。

46、本发明的一些实施例中，所述抗链霉亲和素抗体阻断剂包括streptavidinrec.inactive,poly。

47、本发明的一些实施例中，正干扰的待测样本中加入抗链霉亲和素抗体阻断剂终浓度≥4mg/ml以减少干扰。

48、本发明的一些实施例中，负干扰的待测样本加入抗链霉亲和素抗体阻断剂终浓度≥0.4mg/ml以减少干扰。

49、本发明的一些实施例中，所述干扰样本采用阴性血清样本进行梯度稀释。

50、本发明的有益效果：

51、(1)本发明提供的抗链霉亲和素抗体检测试剂盒专一地检测到抗链霉亲和素抗体(asa)，用于评估基于链霉亲和素-生物素系统的体外诊断试剂产品的异常检测结果是否存在抗链霉亲和素抗体的干扰。

52、(2)本发明提供的抗链霉亲和素抗体检测试剂盒，成本费用低廉，制备方法简单，可实现自动化检测，便于普及推广。

53、(3)本发明提供的抗链霉亲和素抗体检测试剂盒和检测方法，能定量的检测抗链霉亲和素抗体(asa)的浓度；其灵敏度高，可检测到0.220ng/ml。