一种干式三电极电化学发光芯片

1.本实用新型属于医学分析仪器技术领域，具体地说，涉及一种可实现谷丙转氨酶和糖化血红蛋白的定量检测的干式三电极电化学发光芯片。


背景技术：

2.谷丙转氨酶(alt)又称谷氨酸转氨酶，当肝组织被破坏时，alt就会从细胞中释放，导致血液中alt的含量快速增加，因此被世卫组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。目前alt酶活力检测的常规方法有分光光度法、比色法和色谱层析法，但这些方法通常灵敏度低、检测前处理条件严苛和检测纯度要求较高，并且需要配套大型仪器(如分光光度计、酶标仪和生化分析仪等)，这些仪器价格昂贵、专业度高、操作复杂、体积大、检测时间长和维护成本高，使得基层医疗机构、基层血站和家庭没有能力购买使用。
3.糖化血红蛋白(hba1c)由血液中红细胞与血清中葡萄糖在非酶条件下生成。该反应存在于血红细胞中，具有缓慢且不可逆的特点，其在红细胞中的含量可反映人体内三到四个月的平均血糖水平。相较于波动较大的血糖，hba1c在检测人体是否患有糖尿病时，不受空腹、注射胰岛素或服用降糖药物的影响，已成为目前国际上糖尿病控制与监测的金标准。目前，医院检测hba1c的常规方法为使用大型生化分析仪进行液相光谱学检测，实验室选择的检测方案多为试剂盒抗原检测。以上方法单次检测周期长、成本高，检测仪器体积大、价格昂贵且多需专业人员进行操作。
4.目前传统的液相及湿化学检测中，电化学发光芯片材料一般为无机材料或聚合物材料，电极材料价格昂贵，涉及电化学发光芯片的加工设备昂贵，电化学发光芯片修饰过程繁琐，不易快速方便使用，这些都极大地限制了电化学发光芯片的应用场景。


技术实现要素：

5.本实用新型的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种结构简单、操作方便、检测精确、装配简易且不需要专业人员便可实现快速检测的干式三电极电化学发光芯片。
6.为了实现上述目的，本实用新型所采用的技术方案如下：
7.一种干式三电极电化学发光芯片，包括检测片和外壳，外壳包括上盖和底座，检测片设于上盖和底座之间，检测片包括底板、电极片和载体片，电极片粘附于底板下方，载体片粘附于底板上方，电极片的基底上设有对电极、参比电极和工作电极，对电极、参比电极和工作电极的电极触点位于基底的电连接区，载体片上设有亲水区域，亲水区域干化固定有对应待测生物标志物的多种反应试剂，上盖设有进样口和开口槽，进样口与载体片的亲水区域重合，开口槽对应电极片的电连接区。
8.进一步地，待测生物标志物为谷丙转氨酶alt或果糖基缬氨酸fv。
9.进一步地，待测生物标志物为谷丙转氨酶alt，载体片的干化固定反应试剂包括鲁米诺、l-丙氨酸、α-酮戊二酸、丙酮酸氧化酶pyod、氯化镁mgcl2和硫胺素焦磷酸tpp。
10.进一步地，待测生物标志物为果糖基缬氨酸fv，载体片的干化固定反应试剂包括
鲁米诺和果糖基缬氨酸氧化酶faod。
11.进一步地，载体片采用亲水性纤维材料，亲水性纤维材料可为无尘纸。
12.进一步地，电极片的基底采用疏水性纤维材料，疏水性纤维材料可为疏水布。
13.进一步地，上盖内设有固定件，底座内设有凹槽，检测片放置于凹槽内，固定件压在检测片上。
14.进一步地，工作电极上设有圆形区域，工作电极的圆形区域与载体片的亲水区域对应设置。
15.进一步地，电极片和载体片通过丝网印刷技术丝印而成。
16.进一步地，上盖和底座通过3d打印设备打印而成。
17.与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
18.1、本实用新型将三电极电化学发光与干化学技术结合，采用无尘纸把反应试剂预先固相化，使其结构更加简单，制作更容易，具有良好的灵敏度和线性范围，满足alt和hba1c的临床检测要求，检测技术性价比高、可操作性强和适用范围广。
19.2、本实用新型采用待测溶液垂直流动方式，进样口和检测片上的载体片的亲水区域对齐，待测物质与载体片上的化学试剂可立即接触，且快速反应，极大地减小了常规侧向流试纸条因流动方式引起的检测误差和时间成本。
20.3、本实用新型直接滴加待测溶液便可实现检测，极大地简化了alt和hba1c的检测步骤，省力且省时、操作简单、无需专业人员，有利于在基层医疗单位、流动采血车、实验室、家庭及健康体检中心等场合应用和推广。
附图说明
21.图1为干式三电极电化学发光芯片的结构示意图。
22.图2为检测片的分解示意图。
23.图3为电极片的结构示意图。
24.图4为载体片的结构示意图。
25.图5为上盖的结构示意图。
26.图6为底座的结构示意图。
27.图7为全自动干式三电极电化学发光分析仪的结构示意图。
28.图8为电化学发光ecl强度值与谷丙转氨酶alt浓度的关系图，插图a为alt浓度在5-50u/l范围内时，ecl强度值与alt浓度的线性关系图；插图b为alt浓度在50-1000u/l范围内时，ecl强度值与alt浓度的线性关系图。
29.图9为ecl强度值与果糖基缬氨酸fv浓度的关系图，插图a为fv浓度在0.05-0.5mm范围内时，ecl强度值与fv浓度的线性关系图；插图b为fv浓度在0.5-2mm范围内时，ecl强度值与fv浓度的线性关系图。
30.附图标号说明：
31.检测片-1；外壳-2；上盖：2-1；底座：2-2；底板-3；电极片-4；载体片-5；对电极-6；参比电极-7；工作电极-8；圆形区域-9；电连接区-10；疏水区域-11；亲水区域-12；进样口-13；开口槽-14；固定件-15；凹槽-16；干式三电极电化学发光芯片-17；
32.全自动电化学发光分析仪-18；数据处理与仪器控制单元：18-1；成像检测单元：
18-2；电化学反应激励单元：18-3；开放式检测窗口单元：18-4；可充电电源：18-5；显示屏：18-6；壳体：18-7；检测台：18-4-1；传送台：18-4-2。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本实用新型干式三电极电化学发光芯片作进一步说明。
34.实施例1
35.请参阅图1、图2和图7，本实用新型公开了一种干式三电极电化学发光芯片17，干式三电极电化学发光芯片17设置于全自动电化学发光分析仪18内。干式三电极电化学发光芯片包括检测片1和外壳2，外壳2包括上盖2-1和底座2-2，检测片1设于上盖2-1和底座2-2之间。检测片1包括底板3、电极片4和载体片5，电极片4粘附于底板3下方，载体片5粘附于底板3上方。
36.请参阅图2、图3和图4，电极片4的基底上设有对电极6、参比电极7和工作电极8，工作电极8上设有圆形区域9，对电极6、参比电极7和工作电极8的电极触点位于基底的电连接区10。载体片5上包括疏水区域11和亲水区域12，载体片5的亲水区域12干化固定有多种反应试剂，工作电极8的圆形区域9与载体片5的亲水区域12对应设置。
37.请参阅图1、图5和图6，上盖2-1设有进样口13和开口槽14，进样口13与载体片5的亲水区域12重合，开口槽14对应检测片1的电连接区10。上盖2-1内部设有固定件15，底座2-2内设有凹槽16，检测片1放置于凹槽16内，固定件15压在检测片1上，固定件15与凹槽16配合将底板3，电极片4和载体片5固定。
38.进行alt检测时，载体片5的干化固定反应试剂包括鲁米诺、l-丙氨酸、α-酮戊二酸、丙酮酸氧化酶(pyod)、氯化镁(mgcl2)和硫胺素焦磷酸(tpp)。对待测溶液中的alt进行即时检测，其检测原理如下：l-丙氨酸和α-酮戊二酸在alt催化作用下形成丙酮酸和l-谷氨酸，丙酮酸在pyod(mgcl2和tpp为辅酶因子)作用下被氧化，生成过氧化氢(h2o2)、乙酰磷酸和二氧化碳，h2o2进一步作为鲁米诺ecl反应体系的增强剂，根据ecl强度值可以计算得到alt浓度。
39.进行hba1c检测时，载体片5的干化固定反应试剂包括鲁米诺和果糖基缬氨酸氧化酶(faod)。通过对待测溶液中的果糖基缬氨酸(fv)进行检测，以间接对hba1c进行即时检测，其检测原理为：血样中红细胞裂解后，一单位hba1c裂解产生两单位fv，fv在faod作用下产生h2o2，h2o2又作为鲁米诺ecl反应体系的增强剂，根据ecl强度值，通过计算可获得hba1c的含量。
40.电极片4的基底采用疏水性纤维材料，疏水性纤维材料可为疏水布。载体片5采用亲水性纤维材料，亲水性纤维材料可为无尘纸。无尘纸是天然木浆面与涤纶面的有机结合，具有韧性足、抗溶、吸液强和透光率较好等优点，很好地满足了试剂干化、传感器组装、待测溶液吸附和ecl信号采集的要求。
41.本实用新型巧妙地将三电极电化学发光与干化学技术结合，采用低成本的无尘纸把整个反应过程中的反应试剂预先固相化，把传统试纸条中多层试纸(比如试剂层、辅助层、透光层或扩散层等)的功能全部整合至单层无尘纸中，使其结构更加简单，制作更容易，利用单层纸技术实现了alt和hba1c的定量检测。
42.本实用新型采用待测溶液垂直流动方式，上盖2-1的进样口13和检测片1的载体片5的亲水区域12对齐，待测物质与载体片5上的化学试剂可立即接触，且快速反应，极大地减小了常规侧向流试纸条因流动方式引起的检测误差和时间成本。
43.本实用新型干式三电极电化学发光芯片的制作方法，具体包括以下步骤：
44.s1、利用adobe illustrator软件设计电极片4和载体片5，由此制作相应的丝网印刷网板，进一步通过丝网印刷技术制成电极片4和载体片5；利用solidworks软件设计外壳2，经由3d打印设备制作而成。
45.s2、制备干化固定反应试剂的载体片5。
46.其中，对应alt检测的载体片5的制备方法为：首先将30μl 12.5mm鲁米诺滴加至载体片5的亲水区域12，再将其放置在34℃烘箱中干燥30分钟；其次将30μl的700mm l-丙氨酸和10mmα-酮戊二酸的混合溶液滴加至载体片5的亲水区域12，再将其放置在室温下晾干；最后将10μl的1.25g/l pyod、2.5mm mgcl2和2.5mm tpp的混合溶液滴加至载体片5的亲水区域12并室温晾干，从而得到固定有反应试剂的载体片5。
47.其中，对应hba1c检测的载体片5的制备方法为：首先将10μl15 mm的鲁米诺滴加至载体片5的亲水区12，再将其放置在34℃烘箱中干燥1小时；然后将7.5μl 50u/ml添加有保护剂的faod溶液滴加至载体片5的亲水区域12，放置在4℃冰箱中干燥4小时，从而得到固定有反应试剂的载体片5。
48.s3、将制备好的电极片4对齐底板3下侧并粘附，再将制备好的载体片5粘贴在底板3上侧空出的2mm区域，使工作电极8的圆形区域9中心与载体片5的圆形亲水区域12中心对齐，得到干式三电极电化学发光芯片17的检测片1；将检测片1置于外壳2的底座2-2的凹槽16中，将上盖2-1与底座2-2进行组装，且保证上盖2-1的进样口13和检测片1上的载体片5的圆形亲水区域12对齐，从而得到干式三电极电化学发光芯片17。
49.本实用新型首次实现干式三电极电化学发光技术及其用于alt和hba1c即时检测，提供了一种稳定可靠、反应速度快、试剂用量少、线性范围宽、灵敏度高和成本低的一种三电极电化学发光技术及alt、hba1c现场定量检测方法，为医疗机构、基层血站、实验室及个人家庭等提供一种潜在的高性价比检测方法。
50.请参阅图7，全自动电化学发光分析仪18包含数据处理与仪器控制单元18-1、成像检测单元18-2、电化学发光反应激励单元18-3、开放式检测窗口单元18-4、可充电电源18-5、显示屏18-6和壳体18-7，数据处理与仪器控制单元18-1分别与显示屏18-6、成像检测单元18-2、电化学反应激励单元18-3和可充电电源18-5连接，可充电电源18-5分别与显示屏18-6、电化学反应激励单元18-3和开放式检测窗口单元18-4连接。
51.数据处理与仪器控制单元18-1搭载树莓派微处理器，通过软件来实现对仪器的控制以及图像信号的处理与分析。成像检测单元18-2包括cmos相机、物镜和支架，物镜安装在相机上，相机固定在支架上。电化学反应激励单元18-3包括三电极电化学发光激励电路，用于激发电化学发光反应。开放式检测窗口单元18-4包括传送台、检测台和电极触点，检测台位于传送台上，检测台上放置干式三电极电化学发光芯片17，电极触点与检测片1上的电极片4的电连接区10相连。
52.本实施例中全自动干式三电极电化学发光分析仪的检测操作步骤如下：
53.在实验开始前，先打开可充电电源18-5，干式三电极电化学发光芯片17被固定在
开放式检测窗口单元18-4的检测台18-4-1上，检测台18-4-1位于传送台18-4-2上。从上盖2-1的进样口13处滴加待测溶液，利用垂直流动的方式，溶液被快速吸附在载体片5的亲水区域12上，并与载体片5上固定的干化试剂发生反应。与此同时，载体片5的亲水区域12与电极片4的对电极6、参比电极7、工作电极8通过溶液紧密吸附。通过电机将传送台18-4-2自动地传送至成像检测单元18-2物镜的正下方，开放式检测窗口单元18-4中的电极触点与检测片1中的电连接区10相连，等待几分钟后，启动电化学反应激励单元18-3，数据处理与仪器控制单元18-1自动定位电化学发光发光区域的坐标，并自动得到最大电化学发光强度值并显示在显示屏18-6上，然后记录、保存数据以备进一步分析。
54.本实用新型首次把干式三电极电化学发光技术应用于alt和hba1c检测，具有良好的灵敏度和线性范围，满足alt和hba1c的临床检测要求，检测技术性价比高、可操作性强和适用范围广，极大地简化了alt和hba1c的检测步骤，省力且省时、操作简单、无需专业人员，直接滴加待测溶液便可实现检测，有利于在基层医疗单位、流动采血车、实验室、家庭及健康体检中心等场合应用和推广。
55.本实用新型实现了干式三电极电化学发光芯片的批量生产，可实现基于酶底物检测原理的不同靶标(血糖、尿酸、乳酸、hba1c和alt等)的定量即时检测，采用低成本全自动电化学发光分析仪，其装配简易、集成度高、体积小、检测准确和应用场景广泛，只需简单操作即可达到样品进/结果出的检测效果。
56.实施例2
57.本实施例为全自动干式三电极电化学发光分析仪在检测alt中的应用，具体如下：
58.1.优选实验参数，包括曝光时间、激励电压、l-丙氨酸浓度、α-酮戊二酸浓度、鲁米诺浓度、pyod浓度和反应时间。其中，曝光时间范围为100～600ms，优选400ms；激励电压范围为0.5～2.5v，优选1.5v；l-丙氨酸浓度范围为400～900mm，优选700mm；α-酮戊二酸浓度范围为2.5～20mm，优选10mm；鲁米诺浓度范围为5～15mm，优选12.5mm；pyod浓度范围为0.25～2g/l，优选1.25g/l；反应时间范围为5～14分钟，优选10分钟。
59.2.根据优选的实验参数，制作干式三电极ecl芯片和调节配套的全自动电化学发光分析仪。
60.3.设置若干实验组，alt浓度设置为几个不同值：0u/l、5u/l、10u/l、20u/l、50u/l、100u/l、200u/l、500u/l、1000u/l。
61.4.检测操作步骤同实施例1，检测结果如图8所示。
62.从图8可以看出，alt浓度在0-1000u/l范围内时，ecl强度值随alt浓度的增加而增大。此外，alt浓度在5-50u/l范围内变化时，ecl强度值(用y表示)与alt浓度(用x表示)表现出一定线性关系，其线性方程可表达为y＝0.748x-0.558(r2＝0.9928)(插图a)；当alt浓度在50-1000u/l范围内变化时，ecl强度值(用y表示)与alt浓度对数(用x表示)表现出一定线性关系，其线性方程可表达为y＝41.651x-34.114(r2＝0.9856)(插图b)。最后，利用线性方程计算所得的alt检测限估算为1.7015u/l。检测限的计算方法为：y
l
＝yb+3sb，其中yb表示空白对照时平均ecl强度值，sb为空白对照的标准偏差(五次重复实验)，利用所得y
l
值计算出相应的alt浓度即为检测限。
63.实施例3
64.本实施例为全自动干式三电极电化学发光分析仪在检测hba1c中的应用，具体如
下：
65.1.优选实验参数，包括曝光时间、激励电压、反应时间、缓冲液ph、鲁米诺浓度和faod浓度。其中，曝光时间范围为100～1000ms，优选400ms；激励电压范围为0.5～2.5v，优选1v；反应时间范围为0.5～5分钟，优选3分钟；缓冲液ph范围为8～12，优选9.5；鲁米诺浓度范围为5～30mm，优选20mm；faod浓度范围为10～100u/ml，优选50u/ml。
66.2.根据优选的实验参数，制作干式三电极ecl芯片和调节配套的全自动电化学发光分析仪。
67.3.设置若干实验组，hba1c浓度设置为几个不同值：0mm、0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm、0.75mm、1mm、2mm。
68.4.检测操作步骤同实施例1，除了增加待测溶液预处理步骤：将含有hba1c的待测溶液加入含有细胞裂解液的试管中，使hba1c裂解后产生游离的fv，检测结果如图9所示。
69.从图9可以看出，fv浓度在0-2mm范围内时，ecl强度值随fv浓度的增加而增加。此外，当fv浓度在0.05-0.5mm范围内变化时，ecl强度值(用y表示)与fv浓度(用x表示)之间具有良好的线性关系，线性方程可表达为y＝7.339x+0.063(r2＝0.9990)(插图a)；当fv浓度在0.5-2mm范围内变化时，ecl强度值(用y表示)与fv浓度对数值(用x表示)之间具有良好的线性关系，线性方程可表达为y＝1.382x+2.992(r2＝0.9746)(插图b)。最后，利用线性方程计算所得的fv检测限估算为0.0022mm。检测限的计算方法为：y
l
＝yb+3sb，其中yb表示空白对照时平均ecl强度值，sb为空白对照的标准偏差(五次重复实验)，利用所得y
l
值计算出相应的fv浓度即为检测限。最后，通过hba1c与fv的对应比例关系，即可获得待测溶液中hba1c的含量及检测限。
70.上述说明是针对本实用新型较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本实用新型的专利申请范围，凡本实用新型所揭示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本实用新型所涵盖专利范围。