一种流式荧光检测光学系统的制作方法

1.本实用新型涉及生物光学技术领域，尤其涉及一种流式荧光检测光学系统。


背景技术：

2.液态芯片分析体系由许多大小均一的圆形微球(直径5.5～5.6μm)为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测。
3.在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号，或称荧光编码。在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料(这两种染料各有10种不同区分)，从而把微球分为100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同，这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球，可以分别标记上100种不同的探针分子。
4.检测时先后加入样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子(待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等)能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，将荧光标记后的微球悬液进入吸样管，进而随鞘液进入流动室。流动室(鞘流池flowcell)是指截面为方形的抛光腔体，当血液样品在流动液的包裹下，以层流形式通过光检测区，在特殊激光光源的照射下，对透过光以及散射光的分析，从而可以详细分析样品的组成。当带有微球的样本通过流动室时，微球在一定范围内波动，当这种波动的样本经过光斑时，由于光斑为高斯分布，其能量分布不均匀，会造成样本经过光斑不同位置时其产生的光信号幅值也会发生变化，从而影响信号的稳定性。
5.另一方面，微球被激光照射后会产生相应的荧光信号，一般通过滤光片来选择需要接收的荧光信号，滤光片滤除掉不需要的荧光波段，但是滤光片的特性是不能完全滤除掉不需要的荧光，还是有一定比例的光信号进入探测器，这样就会导致对需要的荧光信号造成干扰，影响信号的稳定性。


技术实现要素：

6.本实用新型的目的在于提供一种流式荧光检测光学系统，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的本实用新型所采用的技术方案是：
8.一种流式荧光检测光学系统，包括：
9.一个流动室；
10.前光组件，位于流动室的其中一侧，包括激光器、正负透镜、柱面镜和球面聚焦镜，所述前光组件用于产生平顶激光光斑；该平顶激光光斑辐照在微球上产生散射光和荧光信号；
11.前向散射光组件，位于流动室设置有前光组件一侧的对称侧，用于接收激光光斑
照射在微球上产生的前向散射光；
12.一路荧光信号接收组件，位于流动室的另一侧，包括荧光探测器、聚焦透镜、滤光片和荧光收集透镜，用于接收该路至少一个目标荧光信号；
13.另一路荧光信号接收组件，位于流动室的设置有上述一路荧光信号接收组件一侧的对称侧，包括荧光探测器、聚焦透镜、滤光片和荧光收集透镜，用于接收不同于上述一路荧光信号的其他至少一个目标荧光信号。
14.上述一种流式荧光检测光学系统，所述前光组件的正负透镜为负球面镜和正球面镜；柱面镜为第一正柱面镜和第二正柱面镜；上述负球面镜和正球面镜组成一个望远镜系统对激光束进行放大或者缩小；然后激光束经过第一正柱面镜和第二正柱面镜，第一正柱面镜对x轴方向光斑进行整形，第二正柱面镜对y轴方向光斑进行整形。
15.上述一种流式荧光检测光学系统，经过第一正柱面镜和第二正柱面镜整形之后的激光光斑，经过球面镜聚焦得到y方向15um-20um，x方向80um-100um的光斑，该光斑辐照在微球上，能够在x轴方向产生一种局部平顶光束。
16.上述一种流式荧光检测光学系统，所述一路荧光信号接收组件为pe荧光信号接收组件，还包括位于荧光收集透镜和滤光片之间的第三二向色镜、第四二向色镜。
17.上述一种流式荧光检测光学系统，所述一路荧光信号接收组件为pe荧光信号接收组件，还包括位于荧光收集透镜和滤光片之间的全反射镜。
18.上述一种流式荧光检测光学系统，所述另一路荧光信号接收组件为fitc荧光信号和percp荧光信号接收组件，还包括位于荧光收集透镜后的一个共用的第一二向色镜，第一二向色镜后面分为两个分路，其中一分路上设置有用于接收fitc荧光信号的滤光片和聚焦透镜及荧光探测器；另一分路上设置有用于接收percp荧光信号的滤光片和聚焦透镜及荧光探测器。
19.上述一种流式荧光检测光学系统，用于接收fitc荧光信号的分路上还设置有位于第一二向色镜和滤光片之间的第二二向色镜。
20.上述一种流式荧光检测光学系统，所述前向散射光组件包括挡光条、散射收集透镜、滤光片和散射接收器。
21.上述一种流式荧光检测光学系统，所述前向散射光组件中的滤光片为488nm滤光片。
22.综上所述，本实用新型的有益效果是：
23.由于前光组件包括依次布置的激光器、正球面透镜、负球面透镜、第一柱面镜、第二柱面镜和球面聚焦镜，其中负球面镜和正球面镜组成一个望远镜系统(正球面镜和负球面镜顺序可以调换)，该望远镜系统对激光束进行放大或者缩小；然后激光束经过第一正柱面镜和第二正柱面镜，第一正柱面镜对x轴方向光斑进行整形，第二正柱面镜对y轴方向光斑进行整形；最终光束经过球面镜聚焦得到y方向15um-20um，x方向80um-100um的光斑，经过以上光学系统能够在x轴方向产生一种局部平顶光束。让微球在一定范围内摆动，其通过平顶光斑后能量不会发生变化，其产生的光信号也相应的不会发生变化，提升了光信号的稳定性，用该数据计算的cv值能够达到2％以内。
24.由于在流动室的不同侧面分别设置不同的荧光信号接收组件，接受的荧光信号分别通过各自的光路进行接收检测，相互之间不会干涉，使得每一路的荧光信号接收更加精
准。
附图说明
25.图1是本实用新型实施例1一种流式荧光检测光学系统实施例1的光路结构示意图；
26.图2是实施例1前光组件光路结构示意图；
27.图3是实施例1平顶光束示意图；
28.图4是实施例1微球流动和光斑相对位置示意图；
29.图5是实施例1测试数据分布示意图；
30.图6是实施例1散射光组件示意图；
31.图7是实施例1pe荧光接收组件示意图；
32.图8是实施例1fitc和percp荧光接收组件示意图；
33.图9是实施例2中的pe荧光接收组件示意图；
34.图10是实施例2中的fitc和percp荧光接收组件示意图。
35.图中：1流动室，2第一荧光收集透镜，3第二荧光收集透镜，,41激光器，42负透镜，43正透镜，44x方向柱面镜，45y方向柱面镜，46球面聚焦镜，51第一荧光接收器，52第一聚焦透镜，53第一滤光片，54全反射镜，61第一二向色镜，62滤光片，63第二聚焦透镜，64第二荧光接收器，71第三滤光片，72第三聚焦透镜，73第三荧光接收器，81挡光条，82散射收集透镜，83第四滤光片，84散射光接收器，第二二向色镜9，第三二向色镜10，第四二向色镜11。
具体实施方式
36.以下结合附图对本实用新型的实施方式做进一步详细描述，应当指出的是，实施例只是对本实用新型的详细阐述，不应视为对本实用新型的限定，本实用新型的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合。
37.实施例1
38.一种流式荧光检测光学系统包括流动室1，前光组件，前向散射光组件、pe荧光信号接收组件、fitc荧光信号接收组件、percp荧光信号接收组件，如图1所示。其中pe荧光信号接收组件呈一路荧光信号接收组件，位于流动室1的一侧。fitc荧光信号接收组件和percp荧光信号接收组件形成另一路荧光信号接收组件，位于流动室1的另一侧。
39.前光组件主要用来产生平顶激光光斑，该光斑辐照在微球上产生散射光和荧光信号。如图2所示，前光组件主要有以下光学镜子和激光器41构成，其中光学镜子包括负球面镜42、正球面镜43、第一正柱面镜即x方向柱面镜44、第二正柱面镜即y方向柱面镜45和球面聚焦镜46。激光器41输出的激光依次经过负球面镜42、正球面镜43、x方向柱面镜44、y方向柱面镜45和球面聚焦镜46。其中负球面镜42和正球面镜43组成一个望远镜系统(正球面镜43和负球面镜42顺序可以调换)，该望远镜系统对激光束进行放大或者缩小；然后激光束经过x方向柱面镜44和y方向柱面镜45，x方向柱面镜44对x轴方向光斑进行整形，y方向柱面镜45对y轴方向光斑进行整形；最终光束经过球面聚焦镜46聚焦得到y方向15um-20um，x方向80um-100um的光斑，该光斑辐照在微球上。经过以上光学系统能够在x轴方向产生一种局部
平顶光束，如图3所示。所以本实用新型的流式荧光检测光学系统中的前光组件产生一种平顶激光光斑辐照在微球上，当微球通过平顶光斑时，微球的波动不会导致信号的波动，提高了仪器的稳定性。
40.如图4所示，微球在一定范围内摆动，其通过平顶光斑后能量不会发生变化，其产生的光信号也相应的不会发生变化，提升了光信号的稳定性。图5是用该系统测量微球的光信号数据，用该数据计算的cv值能够达到2％以内。
41.如图1和图8所示，散射光接收组件主要用来接收激光照射在微球上产生的前向散射光，主要由光束阻挡器，散射收集透镜82，第四滤光片83和散射光接收器84组成。本实施例中的光束阻挡器采用的是挡光条81。散射光接收器84即pd收集器。光束阻挡器主要用来吸收透射过微球的激光，避免其对散射光造成干扰；散射收集透镜82用来收集微球产生的散射光信号，散射收集透镜82为非球面透镜；第四滤光片83用来滤去散射光波段(488nm/10nm)以外的光信号，pd收集器用于收集散射光信号，将光信号转为电信号输出。
42.本实施例中的其中一路荧光收集信号为pe荧光，当然具体实施时可根据需要选择不同的荧光。如图1和如6所示，pe荧光接收组件主要用来接收pe荧光，主要由第二荧光收集透镜3、全反射镜54，第一滤光片53、第一聚焦透镜52以及第一荧光接收器51组成。第二荧光收集透镜3为非球面透镜，收集的荧光信号经过全反射镜54，第一滤光片53后的光信号波段在565nm-585nm之间，通过滤光片的光信号经过第一聚焦透镜52照射在第一荧光接收器51上，第一荧光接收器51可以为apd(雪崩光电二极管)或者pmt(光电倍增管)。
43.如图1和图7所示，本实施例的另一路位于流动室另一侧的荧光收集组件为fitc荧光信号接收组件和percp荧光信号接收组件，fitc荧光信号接收组件和percp荧光信号接收组件共用一个第一荧光收集透镜2和第一二向色镜61，经过第一二向色镜61的光信号被分成两路，其中一路经过第三滤光片71，第三聚焦透镜72被第三荧光接收器73接收；即光信号经过第三滤波片71选择500nm-520nm的光信号通过，滤除其他光信号；500nm-520nm的光信号通过聚焦透镜照射在第三荧光接收器73上。另一路荧光信号经过滤光片62，第二聚焦透镜63被第二荧光接收器64接收；即该路光信号经过滤光片62选择740nm-760nm的光信号通过，滤除其他光信号；740nm-760nm的光信号经过第二聚焦透镜63后辐照在第二荧光接收器64上。第三荧光接收器73和第二荧光接收器64可以为apd(雪崩光电二极管)或者pmt(光电倍增管)。通过二向色镜滤除掉不需要的荧光波段，最终通过滤光片选择需要的荧光波段，这种光路系统可以最大化的去除掉干扰荧光，提升光信号的稳定性。
44.具体实施时，上述另一路位于流动室另一侧的荧光收集组件为fitc荧光信号接收组件和percp荧光信号接收组件也可以设置成只接收一个荧光目标信号的接收组件。这样结构与接收pe信号的接收组件结构一样，只是滤波片更改为与对应目标荧光信号匹配的即可。进一步的，实施例1中各目标荧光信号也不限于上述几种，具体实施时跟根据需要，调整匹配的光学镜来实现各种其他目标信号的接收。
45.综上所述，本实施例的流式荧光检测光学系统的前光组件能够产生一种平顶激光光斑辐照在微球上，当微球通过平顶光斑时，微球的波动不会导致信号的波动，提高了仪器的稳定性。且本实用新型的流式荧光检测光学系统采用在流动室相对两侧分别设置不同荧光信号的收集路线，这样不同信号荧光之间相互干涉极少，使得收集到的荧光信号更加精准。
46.实施例2
47.本实施例的其他结构与实施例1相同，其区别结构在于：如图9所示，其中pe荧光信号一路中的全反射镜54用第四二向色镜11代替，同时在上述第四二向色镜11和第一滤波片53之间再设置一个第三二向色镜10。荧光信号经过第四二向色镜11，第四二向色镜11透射600nm波段以上的光信号，反射520nm-585nm的光信号；反射的光信号经过第三二向色镜10，第三二向色镜10反射544nm波段以下的光信号，透射558nm波段以上的光信号，因此透过第三二向色镜10的光信号波段在558nm-585nm之间，然后第一滤波片53透过565nm-585nm光信号，其他光信号被第一滤波片53滤除；通过第一滤波片53的光信号经过第一聚焦透镜52照射在第一荧光接收器51上。pe荧光接收组件通过第四二向色镜11和第三二向色镜10将不需要的光信号滤除，然后再通过第一滤波片53将不需要的光信号滤除，即通过多次滤除不需要的光信号来提高接收的光信号稳定性。
48.如图10所示，fitc荧光信号这一路中的第一二向色镜61和第三滤光片71之间还设置有第二二向色镜9，第一二向色镜61反射小于596nm以下的光信号，透射大于600nm以上的光信号；第二二向色镜9反射小于500nm的光信号，透射大于500nm的光信号，第三滤光片71选择500nm-520nm的光信号通过，滤除其他光信号；500nm-520nm的光信号通过第三聚焦透镜72被第三荧光接收器73接收。第二二向色镜9透射的光信号经过第三滤光片71选择500nm-520nm的光信号通过，滤除其他光信号；500nm-520nm的光信号通过第三聚焦透镜72照射在第三荧光接收器73上。
49.本实施例的流式荧光检测光学系统通过多个二向色镜滤除掉不需要的荧光波段，最终通过滤光片选择需要的荧光波段，这种光路系统可以最大化的去除掉干扰荧光，提升光信号的稳定性。
50.结合上述两个实施例可知，现有产品的流式荧光检测光学系统直接产生一种高斯分布的光斑辐照在微球上，这种光斑分布不能包容微球的波动，从而带来光信号的波动，降低了仪器的性能；且通过直接用收集透镜收集荧光，然后用滤光片滤除掉不需要的荧光的方式收集荧光信号。由于滤光片不能100％滤除掉不需要的荧光，所以会有部分不需要的荧光或者干扰光进入探测器，影响信号的稳定性。
51.而本实用新型的流式荧光检测光学系统的前光组件能够产生一种平顶激光光斑辐照在微球上，当微球通过平顶光斑时，微球的波动不会导致信号的波动，提高了仪器的稳定性。且本实用新型的流式荧光检测光学系统通过多个二向色镜滤除掉不需要的荧光波段，最终通过滤光片选择需要的荧光波段，这种光路系统可以最大化的去除掉干扰荧光，提升光信号的稳定性。且本实用新型的流式荧光检测光学系统采用在流动室相对两侧分别设置不同荧光信号的收集路线，这样不同信号荧光之间相互干涉极少，使得收集到的荧光信号更加精准。同时这样的设置方式既提升了荧光信号的精准性，又增加了可测荧光信号的数量。(在不同侧也可以扩展设置更多路不同荧光信号检测线路，即采用共用组件的方式，当然还需要将各路不同荧光信号接收器足够间距设置，降低相互干涉度。)
52.以上所述，仅为实用新型的具体实施方式，但实用新型的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在实用新型的保护范围之内，因此，实用新型的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。