LRRC4家族模拟分子及其诊断用途的制作方法

本公开提供了利用lrrc4家族模拟分子测定fam19a5蛋白表达水平的方法。本公开还提供了利用这种lrrc4家族模拟分子诊断疾病或紊乱(例如与fam19a5表达增加相关的疾病或紊乱)和/或鉴定适合fam19a5拮抗剂治疗的受试者的方法。

背景技术：

1、中枢神经系统(cns)的疾病和紊乱包括一组异质性紊乱，这些紊乱通常具有不明病因和发病机制。目前，cns紊乱(如阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)以及其他相关疾病(如创伤性脑损伤(tbi)、神经性疼痛和青光眼)无法治愈，更不用说鉴定受试者对治疗有反应的方法。事实上，在大多数情况下，可用的cns疾病治疗对症状改善的益处相对较小，但本质上仍然起到治标作用。同样，此外，随着全球预期寿命的延长和人口的增长，患有cns疾病和紊乱的个体数量预计将进一步增加。feigin，v.l.等人《柳叶刀神经病学(lancetneurol)》16(11):877-897(2017年)。因此，仍然需要新的、更有效的治疗和/或诊断cns紊乱的方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种测定序列相似家族19成员a5(“fam19a5”)蛋白在有需要受试者中表达水平的方法，包括：(i)使受试者的生物学样品与富含亮氨酸序列4(“lrrc4”)家族模拟分子(能够与fam19a5蛋白特异性结合)接触，(ii)测量生物学样品中fam19a5蛋白的表达水平(“fam19a5蛋白表达水平”)。

2、本发明还提供一种诊断有需要受试者中的疾病或紊乱的方法，包括：(i)使受试者的生物学样品与富含亮氨酸序列4(“lrrc4”)家族模拟分子(能够与序列相似家族19成员a5(“fam19a5”)蛋白特异性结合)接触，(ii)测量生物学样品中fam19a5蛋白的表达水平(“fam19a5蛋白表达水平”)。

3、在一些方面，所述疾病或紊乱与fam19a5蛋白表达水平增加相关。在一些方面，与参照组(例如，未患有疾病或紊乱的受试者中的相应表达水平)相比，生物学样品中fam19a5蛋白表达水平增加。在一些方面，与参照组相比，所述fam19a5蛋白表达水平增加约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。

4、本公开进一步提供一种适合采用对抗序列相似家族19成员a5(“fam19a5”)蛋白的拮抗剂(“fam19a5拮抗剂”)进行治疗的受试者的鉴定方法，包括：(i)使受试者的生物学样品与富含亮氨酸序列4(“lrrc4”)家族模拟分子(能够与fam19a5蛋白特异性结合)接触，(ii)测量生物学样品中fam19a5蛋白的表达水平(“fam19a5蛋白表达水平”)，其中，与参照组(例如，未患有疾病或紊乱的受试者中的相应表达水平)相比，如果所述fam19a5蛋白表达水平有所增加，则受试者适合进行此项治疗。在一些方面，所述受试者之前接受过fam19a5拮抗剂给药。

5、在一些方面，与参照组相比，所述fam19a5蛋白表达水平降低了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

6、在一些方面，所述适合采用fam19a5拮抗剂进行治疗的受试者的鉴定方法进一步包括：在接触和测量后向受试者施用额外剂量的fam19a5拮抗剂。

7、本发明还提供一种在有需要受试者中治疗与序列相似家族19成员a5(“fam19a5”)蛋白表达水平增加相关的疾病或紊乱的方法，包括：通过使受试者的生物学样品与富含亮氨酸序列4(“lrrc4”)家族模拟分子(能够与fam19a5蛋白特异性结合)接触，对受试者进行疾病或紊乱的治疗，并测量所述fam19a5蛋白的表达水平(“fam19a5蛋白表达水平”)。

8、在一些方面，本发明提供的治疗方法进一步包括：与参照组(例如，未患有疾病或紊乱的受试者中的相应表达水平)相比，如果所述fam19a5蛋白表达水平增加，则给予受试者额外剂量的治疗。在一些方面，与参照组相比，所述fam19a5蛋白表达水平增加约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。

9、就本发明提供的任何方法而言，在一些方面，通过酶联免疫吸附测定elisa、免疫组织化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、放射免疫扩散、免疫沉淀法、奥氏免疫扩散法、奥氏免疫扩散法、组织免疫染色法、补体固定试验、流式细胞荧光分选技术(facs)、蛋白芯片技术、单分子免疫阵列(simoa)技术或其任何组合，测量所述fam19a5蛋白表达水平。在一些方面，所述生物学样品包括血液、脑脊液(csf)、血清、血浆、组织、细胞培养基、唾液、尿液或其任何组合。在一些方面，所述接触和测量在体外进行。

10、就本发明提供的任何治疗方法而言，在一些方面，所述治疗包括对抗fam19a5的拮抗剂(“fam19a5拮抗剂”)、富含亮氨酸序列4(“lrrc4”)家族模拟分子或两者兼有。

11、在一些方面，所述fam19a5拮抗剂包括抗体或其抗原结合部分、反义寡核苷酸、sirna、shrna、mirna、靶向fam19a5的dsrna、适配体、pna、包括上述物质的载体或其任何组合。在一些方面，所述fam19a5拮抗剂是抗体或其抗原结合部分。

12、在一些方面，本发明提供的方法的lrrc4家族模拟分子并非抗体或其抗原结合部分。

13、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含如下结构域，或由如下结构域组成，或基本上由如下结构域组成，该结构域是lrrc4蛋白家族成员的结构域，其中，所述结构域能够与fam19a5蛋白(“fam19a5结合结构域”)结合，其中，与相应的全长lrrc4蛋白家族成员相比(seq id no:4；seq id no:5；或seq id no:6)，所述多肽较短。

14、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子的fam19a5结合结构域长度为约10-约23个氨基酸。在一些方面，所述fam19a5结合结构域的长度约为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个氨基酸。在一些方面，所述fam19a5结合结构域的长度为约10个氨基酸。

15、就本发明提供的任何方法而言，在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从n端到c端)：

16、a-(t/s)-b(式i)，其中：

17、(i)a包括x1-(t/s)-(y/f)-f-x5；其中：

18、x1是酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；

19、(t/s)是苏氨酸(t)或丝氨酸(s)；

20、(y/f)是酪氨酸(y)或苯丙氨酸(f)；

21、x5是任何氨基酸；

22、(ii)b包括(v/i)-t-v-(e/v)；其中：

23、(v/i)是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；

24、(e/v)是谷氨酸(e)或缬氨酸(v)。

25、就本发明提供的任何方法而言，在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从n端到c端)：

26、a-(t/s)-b(式i)，其中：

27、(i)a包括(y/w/m)-(t/y)-(y/w)-(f/y/w)–(t/y)；其中：

28、(y/w/m)是酪氨酸(y)、色氨酸(w)或甲硫氨酸(m)；

29、(t/y)是苏氨酸(t)或酪氨酸(y)；

30、(y/w)是酪氨酸(y)或色氨酸(w)；

31、(f/y/w)是苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)；

32、(ii)b包括x7-(t/s/y)-x9-x10；其中：

33、x7是缬氨酸(v)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、色氨酸(w)或甲硫氨酸(m)；

34、(t/s/y)是苏氨酸(t)、丝氨酸(s)或酪氨酸(y)；

35、x9是缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、色氨酸(w)或甲硫氨酸(m)；

36、x10是谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、异亮氨酸(i)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、甲硫氨酸(m)或色氨酸(w)。

37、就本发明提供的任何方法而言，在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基序列(从n端到c端)：

38、x1-x2-x3-f-x5-t-x7-t-v-x10(式ii)，其中：

39、x1是y、f、v、l或i；

40、x2是t或s；

41、x3是y或f；

42、x5是任何氨基酸；

43、x7是v或i；和/或

44、x10是e或v。

45、就本发明提供的任何方法而言，在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列：(从n端到c端)：

46、x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10(式vi)，其中：

47、x1是y、f、v、l、i、w或m；

48、x2是t、s或y；

49、x3是y、f或w；

50、x4是f、y或w；

51、x5是任何氨基酸，例如t、s或y；

52、x6是t、s或y；

53、x7是v、i、y、f、l、w或m；

54、x8是t、s或y；

55、x9是v、i、y、f、l、w或m；和/或

56、x10是e、d、v、i、y、f、m或w。

57、在一些方面，x1是y、f、v、l或i；x2是t或s；x3是y或f；x4是f；x5是t或s；x6是t；x7是v或i；x8是t；x9是v；x10是e或v；或其组合。

58、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含seq id no:29(ytyfttvtve)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽由seq id no:29(ytyfttvtve)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含seq id no:20(nysffttvtvetteispedttrk)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽由seq id no:20(nysffttvtvetteispedttrk)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含seq id no:21(nfsyfstvtvetmepsqderttr)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽由seq id no:21(nfsyfstvtvetmepsqderttr)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含seq id no:18(gytyfttvtvetletqpgee)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽由seq id no:18(gytyfttvtvetletqpgee)中所述的氨基酸序列组成。

59、在一些方面，第x2位氨基酸为磷酸化或o-糖基化氨基酸。

60、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含与seq id no:seqid no:29(ytyfttvtve)中所述的氨基酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

61、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含与seq id no:5、seq id no:4或seq id no:6中所述的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％相同的氨基酸序列，并包含相对于seq id no:5、seq id no:4或seq id no:6中分别所述的氨基酸序列的至少一个氨基酸修饰。在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述多肽与fam19a5蛋白的结合。在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述lrrc4家族模拟分子的稳定性。

62、在一些方面，seq id no:5第453位的氨基酸残基是t或修饰为s或y；seq id no:5第454位的氨基酸残基是t或修饰为s或y；seq id no:5第449位的氨基酸残基是y或修饰为f、v、l、i、w或m；seq id no:5第450位的氨基酸残基是t或修饰为s或y；seq id no:5第451位的氨基酸残基是y或修饰为f或w；seq id no:5第452位的氨基酸残基是f或修饰为y或w；seqid no:5第455位的氨基酸残基是v或修饰为i、y、f、l、w或m；seq id no:5第456位的氨基酸残基是t或修饰为s或y；seq id no:5第457位的氨基酸残基是v或修饰为i、y、f、l、w或m；seqid no:5第458位的氨基酸残基是e或修饰为d、v、i、y、f、m或w；或其组合。

63、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子不包含lrrc4蛋白家族成员的跨膜结构域和/或细胞内结构域。

64、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子进一步包含lrrc4家族模拟分子n端、c端或n端和c端的一个或多个额外氨基酸。在一些方面，所述一个或多个额外氨基酸为亲水性氨基酸、d-氨基酸或两者兼有。

65、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子的n端、c端或n端和c端包含增加所述lrrc4家族模拟分子稳定性的修饰。在一些方面，所述修饰包含芴甲氧羰基、聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、环化或其组合。

66、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子为融合蛋白。在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子进一步包含半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包含fc、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素β亚基c端肽ctp、聚乙二醇peg、长非结构化亲水性氨基酸序列xten、羟乙基淀粉hes、白蛋白结合小分子或其组合。

67、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子包含小分子。

68、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子为式i的小分子：

69、

70、或其药学上可接受的盐，其中：

71、(i)r1、r2和r3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、n-甲基氨基、n-乙基氨基、n-正丙基氨基、n,n-二甲基氨基、n-乙酰氨基、n-丙酰氨基、n-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基；

72、(ii)是单键或双键；

73、(iii)z选自直链或支链(c1-c8)烷基、直链或支链(c2-c8)烯基、直链或支链(c2-c8)炔基、(c3-c8)环烷基、(c5-c8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(c7-c14)双环烯基、(c7-c14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(c6-c10)芳基、(5-10元)杂芳基和-ch-c(o)-ch＝ch-q，其中，q是(c3-c8)环烷基、(c5-c8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(c6-c10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、卤代、(c1-c6)卤代烷氧基、硝基、氨基、n-甲胺基、n-乙胺基、n-n-丙胺基、n,n-二甲氨基、甲酰基和羟基，

74、(iv)l是单键、双键或三键。

75、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子选自以下物质：

76、kb 2356；

77、kb 2357

78、kb 2358；

79、

80、或其药学上可接受的盐。

81、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子为式ii的小分子：

82、

83、或其药学上可接受的盐，其中：

84、(i)r1、r2和r3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、n-甲基氨基、n-乙基氨基、n-正丙基氨基、n,n-二甲基氨基、n-乙酰氨基、n-丙酰氨基、n-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，

85、(ii)z选自直链或支链(c1-c8)烷基、直链或支链(c2-c8)烯基、直链或支链(c2-c8)炔基、(c3-c8)环烷基、(c5-c8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(c7-c14)双环烯基、(c7-c14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(c6-c10)芳基、(5-10元)杂芳基和-ch＝ch-q，其中，q是(c3-c8)环烷基、(c5-c8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(c6-c10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、卤素、(c1-c6)卤代烷氧基、硝基、氨基、n-甲胺基、n-乙胺基、n-n-丙胺基、n,n-二甲氨基、甲酰基和羟基，

86、(iii)l是单键、双键或三键。

87、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子选自以下物质：

88、

89、或其药学上可接受的盐。

90、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子为式iii的小分子：

91、

92、或其药学上可接受的盐，其中：

93、(i)r1、r2和r3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、n-甲基氨基、n-乙基氨基、n-正丙基氨基、n,n-二甲基氨基、n-乙酰氨基、n-丙酰氨基、n-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，

94、(ii)z选自直链或支链(c1-c8)烷基、直链或支链(c2-c8)烯基、直链或支链(c2-c8)炔基、-y-(c3-c8)环烷基、-y-(c5-c8)环烯基、-y-(3-8元)杂环烷基、-y-(c7-c14)双环烯基、-y-(c7-c14)双环烯基、-y-(7-14元)杂双环烷基、-y-(c6-c10)芳基、-y-(5-10元)杂芳基，其中，y是键或c1-c3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自c1-c6烷氧基、c1-c6烷基、卤代、c1-c6卤代烷氧基、硝基、氨基、n-甲胺基、n-乙胺基、n-n-丙胺基、n,n-二甲氨基、甲酰基和羟基中，

95、(iii)l是单键、双键或三键，

96、(iv)n是0或1。

97、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子选自以下物质：

98、

99、或其药学上可接受的盐。

100、在一些方面，所述lrrc4家族模拟分子能够与lrrc4蛋白家族成员竞争与fam19a5蛋白结合。在一些方面，所述lrrc4蛋白家族成员包括lrrc4蛋白、lrrc4b蛋白、lrrc4c蛋白或其组合。

101、在一些方面，所述疾病或紊乱包括肌萎缩侧索硬化症als、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。