分子胶筛选测定及其实施方法与流程

发明领域本文提供的主题涉及筛选具有形成蛋白-蛋白复合物的性质的化合物。更具体地，本文提供的主题涉及筛选测定法，以鉴定能够形成蛋白-蛋白复合物的化合物，该蛋白-蛋白复合物在一些情况下可以被靶向降解。

背景技术：

1、蛋白降解是体内的自然过程，其中蛋白一旦用泛素(如e3泛素连接酶)标记就会经由细胞降解机制(如蛋白酶体)被输送进行降解。蛋白降解过程有助于从细胞系统中去除不需要的蛋白(由于生物学原因)，并将这些蛋白输送到蛋白酶体(也称为细胞的垃圾压实机)。

2、靶向蛋白降解(tpd)使用小分子通过将e3泛素连接酶募集到感兴趣的蛋白(例如在患病状态下鉴定的蛋白)以诱导其泛素依赖性降解来劫持细胞降解机制。tpd在药物开发中很受关注，因为它可以解决先前认为无法用药物治疗的靶标(人类蛋白组的80％)，这些靶标无法用传统的小分子抑制剂抑制，如支架蛋白和转录因子。自第一个降解分子问世以来已有20年了。

3、然而，降解剂的发现和优化仍然是一个缓慢的经验过程。为了定量监测e3连接酶、待标记降解的靶蛋白和降解剂分子之间的蛋白-蛋白复合物形成，已经开发了若干测定形式。然而，所有可用的测定都有一定的局限性。例如，一些测定需要带有人工荧光标签的重组蛋白来生成信号并且需要高蛋白浓度，这不能反映细胞中真实的内源蛋白水平或不能测量真实的热力学结合亲和力。此外，许多测定不是高通量的。

4、具体专利

5、本受让人拥有的题为“uncoupling of dna insert propagation andexpression of protein for phage display”的美国专利号7,897,381提供了包含修饰的t7噬菌体基因组的载体。

6、本受让人拥有的题为“uncoupling of dna insert propagation andexpression of protein for phage display”的美国专利号7,112,435提供了包含修饰的t7噬菌体基因组的表达系统。

7、本受让人拥有的题为“uncoupling of dna insert propagation andexpression of protein for phage display”的美国专利号7,833,741提供了包含修饰的t7噬菌体基因组的异源多肽的制备。

技术实现思路

0、发明概述

1、以下是本发明的概述以提供对本发明的一些方面的基本理解。该概述并非旨在识别本发明的关键/决定性要素或描绘本发明的范围。其唯一目的是以简化形式呈现本发明的一些概念，作为稍后呈现的更详细描述的前序。

2、在各种实施方案中，本文提供了筛选结合感兴趣的靶蛋白和另一种配体蛋白的测试化合物的方法，该方法包括，(i)在存在和不存在测试化合物的情况下，将固定化的配体蛋白与包含核酸标签或可检测标签的感兴趣的靶蛋白一起孵育，其中感兴趣的蛋白和核酸标签不同，(ii)去除任何未结合的感兴趣的蛋白，并且(iii)检测固定化配体蛋白、测试化合物和感兴趣的靶蛋白之间复合物的存在或不存在，其中与不存在测试化合物的情况下相比，存在测试化合物的情况下与固定化配体蛋白结合的感兴趣的靶蛋白的量的增加表明测试化合物结合并促进固定化配体蛋白和感兴趣的靶蛋白之间的蛋白-蛋白复合物形成。在各种其他实施方案中，感兴趣的靶蛋白不直接结合固定化配体蛋白，而是与测试化合物形成蛋白-蛋白复合物，并且测试化合物结合固定化配体蛋白。

3、在许多实施方案中，本文提供了筛选结合感兴趣的靶蛋白和配体蛋白的测试化合物的方法，其中先前未知感兴趣的靶蛋白结合配体蛋白，该方法包括，(i)在存在和不存在测试化合物的情况下，将固定化蛋白与包含可检测标签的感兴趣的靶蛋白一起孵育，其中感兴趣的蛋白和可检测标签彼此不同，(ii)去除任何未结合的感兴趣的蛋白和(iii)检测固定化蛋白、测试化合物和感兴趣的靶蛋白之间的复合物形成的存在或不存在，其中与不存在测试化合物的情况相比，存在测试化合物的情况下与固定化蛋白结合的感兴趣的靶蛋白的量增加，表明测试化合物促进固定化蛋白和感兴趣的靶蛋白之间的蛋白-蛋白复合物形成。

4、在各种实施方案中，本文提供了将测试化合物鉴定为分子胶的方法，其中测试化合物稳定通常不相互作用的两种蛋白之间的相互作用，或者稳定先前未知形成复合物的两种蛋白之间的相互作用，所述方法包括以下步骤：(a)使包含融合蛋白的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述融合蛋白包含感兴趣的靶蛋白和核酸寡聚物标签；(b)在存在固定化配体蛋白的情况下将融合蛋白与测试化合物一起孵育，其中所述配体蛋白固定在固相支持体上；(c)去除任何未结合的融合蛋白；和(d)通过检测与融合蛋白结合的核酸寡聚物标签来检测与固定化配体蛋白结合的融合蛋白的量；其中相对于不存在所述测试化合物的情况下检测到的融合蛋白的量，存在所述测试化合物的情况下检测到的步骤(d)的融合蛋白的量的增加或减少表明测试化合物调节通常不相互作用的两种蛋白之间的相互作用。

5、在各种实施方案中，相对于不存在所述测试化合物的情况下检测到的融合蛋白的量，存在所述测试化合物的情况下检测到的步骤(d)的融合蛋白的量的增加表明测试化合物促进蛋白-蛋白相互作用和复合物形成。在各种其他实施方案中，相对于不存在所述测试化合物的情况下检测到的融合蛋白的量，存在所述测试化合物的情况下检测到的步骤(d)的与配体蛋白结合的融合蛋白的量的减少表明测试化合物不促进蛋白-蛋白相互作用。

6、在许多实施方案中，固定化蛋白可以是配体蛋白，如连接酶。在许多其他实施方案中，固定化配体蛋白可以是e3泛素连接酶。

7、在各种实施方案中，测试化合物可以是分子胶化合物降解剂。在各种其他实施方案中，测试化合物是蛋白水解靶向嵌合体化合物降解剂。

8、在许多实施方案中，感兴趣的靶蛋白在哺乳动物细胞中单独过表达并暴露于测试化合物和固定化配体蛋白两者。感兴趣的靶蛋白单独展示在噬菌体外壳上并暴露于测试化合物和固定化配体蛋白两者。

9、在各种实施方案中，本文提供了将测试化合物鉴定为分子胶的方法，其中分子胶使得先前未知结合的感兴趣的靶蛋白和配体蛋白之间能够形成蛋白-蛋白复合物，该方法包括(i)在存在和不存在测试化合物的情况下，将与核酸序列或核酸标签融合的感兴趣的靶蛋白与固定化蛋白配体一起孵育，(ii)去除任何未结合的靶蛋白，和(iii)通过定量聚合酶链式反应(pcr)或qpcr检测或定量感兴趣的靶蛋白与固定化配体蛋白的结合，其中与不存在测试化合物的情况相比，存在测试化合物的情况下与固定化配体蛋白结合的感兴趣的靶蛋白的量的增加表明，所述测试化合物使得感兴趣的靶蛋白和配体蛋白之间能够形成蛋白-蛋白复合物。在许多实施方案中，感兴趣的靶蛋白不直接与固定化配体蛋白结合，而是与测试化合物形成蛋白-蛋白复合物，并且测试化合物与固定化配体蛋白结合。

10、在各种实施方案中，本文提供了将测试化合物鉴定为分子胶化合物降解剂的方法，其中分子胶化合物降解剂促进先前未知结合的感兴趣的靶蛋白与连接酶之间的蛋白-蛋白复合物，该方法包括(i)在存在和不存在测试化合物的情况下将与核酸寡聚物融合的感兴趣的靶蛋白与固定化连接酶一起孵育，(ii)去除任何未结合的感兴趣的靶蛋白，和(iii)通过定量聚合酶链式反应(pcr)或qpcr检测或定量感兴趣的靶蛋白与固定化连接酶的结合，其中与不存在测试化合物的情况相比，存在测试化合物的情况下结合至固定化连接酶的感兴趣的靶蛋白的量增加表明所述测试化合物使得感兴趣的靶蛋白和连接酶之间能够形成蛋白-蛋白复合物并诱导连接酶依赖性降解。在许多实施方案中，感兴趣的靶蛋白不直接结合固定化连接酶，而是与测试化合物形成蛋白-蛋白复合物，并且测试化合物结合固定化连接酶。

11、在各种实施方案中，可检测标签可以是核酸寡聚物，其中寡聚物与可检测蛋白结合，并且寡聚物可以是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。在一些实施方案中，本文提供的方法包括qpcr扩增与感兴趣的靶蛋白结合的核酸寡聚物。

12、在许多实施方案中，在筛选测定中采用感兴趣的靶蛋白上的核酸标签来从化合物文库中鉴定作为潜在的分子胶的测试化合物，其中测试化合物促进固定化配体蛋白和感兴趣的靶蛋白之间的蛋白-蛋白复合物形成。因此，所公开的方法可用于经由高通量测定来筛选化合物或候选化合物，其中可针对固定化配体蛋白和感兴趣的靶蛋白筛选大的化合物文库，并筛选使得先前未知结合的固定化配体蛋白和感兴趣的靶蛋白之间能够形成蛋白-蛋白复合物的化合物。

13、在许多实施方案中，固定化配体蛋白可以是连接酶，如e3连接酶。e3连接酶或e3泛素连接酶标记靶蛋白或感兴趣的蛋白以进行降解。所公开的筛选测定法鉴定可用作分子胶化合物降解剂，并且使得e3连接酶或e3泛素连接酶与感兴趣的靶蛋白之间能够形成蛋白-蛋白复合物的测试化合物，所述感兴趣的靶蛋白将由e3连接酶泛素化并输送用于降解。

14、在一些实施方案中，本发明公开了筛选测试化合物对蛋白-蛋白复合物的结合亲和力的方法。该方法包括将测试化合物与一种或多种感兴趣的蛋白和配体蛋白一起孵育，其中配体蛋白固定在固体表面上，并评估固定化配体蛋白、感兴趣的蛋白和测试化合物之间的结合特性。

15、在某些实施方案中，本公开提供针对多种感兴趣的蛋白筛选化合物文库的方法。通过该方法，筛选测定有助于用测试化合物筛选一组感兴趣的蛋白，其中一旦测试化合物在感兴趣的蛋白和固定化配体蛋白之间形成蛋白-蛋白复合物，可以进一步单独评估感兴趣的蛋白和测试化合物。

16、在许多实施方案中，感兴趣的靶蛋白在哺乳动物细胞中单独过表达或单独展示在噬菌体外壳上并暴露于测试化合物和固定化配体蛋白两者。

17、在本文提供的方法的各种实施方案中，固定化配体蛋白固定在固相支持体上。在各种其他实施方案中，配体蛋白固定在多孔板上，或者固定化配体蛋白附着至固相支持珠。固定化配体蛋白可以任选地用标签标记，例如但不限于dna标签、荧光标签或光谱标签。

18、该测定可用于鉴定先前未知的感兴趣的蛋白的分子胶化合物降解剂。然后，感兴趣的蛋白可以选择性地被蛋白酶体靶向降解。因此，筛选测定有助于鉴定能够靶向感兴趣的疾病蛋白进行降解的候选药物。

19、在进一步的实施方案中，选择的e3连接酶固定在固相支持珠上，其中选择的e3连接酶将在其n端带有avi标签的情况下克隆，随后纯化并用脱硫生物素标记，然后将标记的连接酶固定在磁性链霉亲和素珠上。

20、在许多实施方案中，配体如蛋白固定在固相支持珠上，其中蛋白将在其n端带有avi标签的情况下克隆，随后纯化并用脱硫生物素标记，并将标记的蛋白固定在磁性链霉亲和素珠上。

21、在许多其他实施方案中，感兴趣的靶蛋白用dna序列标记，其中靶蛋白在哺乳动物或t7噬菌体gateway载体(如nfkb gateway载体)内克隆并使用t7噬菌体展示在哺乳动物细胞中表达。

22、在许多实施方案中，感兴趣的靶蛋白用dna序列标记以形成融合靶蛋白，其中融合靶蛋白在哺乳动物细胞中表达或在t7噬菌体展示系统内表达。

23、在许多实施方案中，本公开涉及分子胶筛选方法，该方法包括将选择的配体蛋白固定在固相支持珠上，将核酸标签标记至感兴趣的靶蛋白以形成融合蛋白，在存在和不存在测试化合物的情况下将融合靶蛋白与固定化配体蛋白一起孵育，洗涤未结合的融合蛋白和测试化合物，并在存在或不存在测试化合物的情况下通过超灵敏qpcr读数检测dna标签，以测量固相支持珠上配体蛋白捕获的靶蛋白的量。在许多实施方案中，超灵敏qpcr读数为融合蛋白上的dna标签。

24、在进一步的实施方案中，所公开的测定可以筛选化合物作为蛋白水解靶向嵌合体的化合物和分子胶化合物两者的特性。

25、本发明还提供了定量固定化配体蛋白如e3连接酶和测试分子之间的相互作用的方法。还包括使用本文描述的技术评估测试分子的药物开发的商业方法。其他方面包括测试分子、药物配制剂以及治疗和/或预防用途。

26、还提供了用于进行本文描述的测定的试剂盒。试剂盒通常包含固定化配体蛋白和融合蛋白以及用于进行本文所述方法的说明书，所述融合蛋白包含感兴趣的靶蛋白和可检测标签。

27、参考以下附图和描述，本测定和方法的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解。本概述是对概念的介绍。通过以下参考附图对优选实施方案的详细描述，本发明的附加方面和优点将显而易见。