用于检测SARS-CoV-2特异性抗体的纳米传感器的制作方法

本公开广义上涉及一种用于检测sars-cov-2特异性抗体存在的纳米传感器。还提供了一种包括多个纳米传感器的测定法，以及涉及使用纳米传感器的多种方法。

背景技术：

1、由sars-cov-2导致的持续流行凸显了快速、准确且符合成本效益的诊断测定法的必要性，以遏制covid-19在国家和全球范围内的传播。除了分子和抗原测试法之外，血清学测定法在实现及时处理和有效应对疫情爆发方面也发挥着关键作用。(1)此类测试法检测因sars-cov-2感染而产生的抗体，在一些患者中，早在症状出现后2天即可检测到这些抗体。(2,3)由于抗体在生物体液中的存留比病毒rna或抗原长得多，因此抗体的存在可以为当前的暴露、病情进展以及过去的感染或免疫提供信息。(4)因此，血清学测试在流行病学监测中至关重要，用于识别因无症状感染或病情轻微而尚未确诊的sars-cov-2感染个体，从而为更好地了解covid-19传播动态提供重要信息。(5,6)免疫学测定法还可以补充抗原或分子测试法，特别是在感染的后期，此时病毒载量在脱落和血清转换后显著降低。(7-9)另外，由于在许多国家已经施用了covid-19疫苗剂量，因此血清学测定法可以成为评估疫苗接种后疫苗有效性和体液应答动力学的关键工具。(10-12)。

2、迄今为止，大多数检测sars-cov-2特异性抗体的血清学测试法都是基于采用重组冠状病毒蛋白的酶联免疫吸附测定法(elisa)或化学发光测定法(clia)。(13,14)。然而，就测定形式而言，经典的免疫测定法是劳动密集型的，并且需要多种试剂以及长时间的孵育、洗涤和反应步骤(2–5h)。(22)因此，开发一种能使用尽可能少的设备提供对sars-cov-2抗体的简易、快速和特异性测定的符合成本效益的血清学测定法仍然是免疫学诊断领域尚未满足的需求。

技术实现思路

1、一方面，提供了一种用于检测sars-cov-2抗体的纳米传感器，其包括使用一种或多种源自sars-cov-2的刺突(s)蛋白或核衣壳(n)蛋白的b细胞线性肽表位官能化的金属纳米颗粒。

2、在一个实施方案中，一种或多种表位与纳米颗粒表面缀合：

3、a)通过生物素-链霉亲和素相互作用，或者

4、b)通过巯基-金属相互作用，其中纳米颗粒涂覆有包含至少4个氨基酸和至少一个半胱氨酸残基的间隔子。

5、在一个实施方案中，一种或多种表位通过生物素-链霉亲和素相互作用而缀合，例如其中金属纳米颗粒涂覆有链霉亲和素(sa)并且表位经过生物素化。

6、在一个实施方案中，一种或多种表位通过巯基-金属相互作用而缀合，例如其中金属纳米颗粒涂覆有巯基化的间隔子并且表位经过巯基化。

7、在一个实施方案中，间隔子包含氨基酸序列calnn。

8、在一个实施方案中，金属选自于由下列组成的组，即金、银以及金和银的组合，例如au50ag50。有利的是，本发明人已经证明包含这些金属的金属纳米颗粒特别适用于所公开的纳米传感器。

9、在一个实施方案中，金属纳米颗粒是金纳米颗粒(aunp)。

10、在一个实施方案中，表位源自刺突(s)蛋白。

11、在一个实施方案中，表位源自刺突蛋白的s1或s2亚基。

12、在一个实施方案中，表位源自刺突蛋白的s2亚基。

13、在一个实施方案中，表位包含选自于由下列组成的组中的氨基酸序列：

14、·tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)(seq id no:3)、

15、·giaveqdkntqevfaqvk(s20p2)(seq id no:4)、

16、·pskpskrsfiedllfnkv(s21p2)(seq id no:5)、

17、·nnaaivlqlpqgttlpkg(n4p5)(seq id no:6)，以及

18、·与上述之一存在至少95％同一性的氨基酸序列。

19、在一个实施方案中，表位包含选自于由下列组成的组中的氨基酸序列：

20、·tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)(seq id no:3)、

21、·giaveqdkntqevfaqvk(s20p2)(seq id no:4)、

22、·pskpskrsfiedllfnkv(s21p2)(seq id no:5)，以及

23、·与上述之一存在至少95％同一性的氨基酸序列。

24、在一个实施方案中，表位包含选自于由下列组成的组中的氨基酸序列：

25、·tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)(seq id no:3)、

26、·pskpskrsfiedllfnkv(s21p2)(seq id no:5)，以及

27、·与上述之一存在至少95％同一性的氨基酸序列。

28、在一个实施方案中，表位包含氨基酸序列tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)或与其存在至少95％同一性的氨基酸序列。

29、在一个实施方案中，使用至少两种不同的表位对纳米颗粒进行官能化，诸如2至20种不同的表位，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的表位。

30、在一个实施方案中，使用两种不同的表位对纳米颗粒进行官能化。

31、在一个实施方案中，至少一种表位源自刺突蛋白的s1亚基，并且至少一种其他表位源自刺突蛋白的s2亚基。

32、在一个实施方案中，两种不同的表位是tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)(seq id no:3)或与其存在至少95％同一性的氨基酸序列，以及pskpskrsfiedllfnkv(s21p2)(seq idno:5)或与其存在至少95％同一性的氨基酸序列。

33、在一个实施方案中，两种不同的表位是tesnkkflpfqqfgrdia(s14p5)或与其存在至少95％同一性的氨基酸序列，以及giaveqdkntqevfaqvk(s20p2)(seq id no:4)或与其存在至少95％同一性的氨基酸序列。

34、在一个实施方案中，使用适于钝化纳米颗粒以对抗生物流体(例如血清、血液或血浆)的物质对纳米颗粒进行钝化，例如通过使用聚合物层来涂覆纳米颗粒。

35、在一个实施方案中，通过使用聚乙二醇(peg)涂覆纳米颗粒来钝化纳米颗粒。

36、一方面，提供了一种用于检测样品中sars-cov-2特异性抗体的存在的体外测定法，包括多个如上文定义的纳米传感器。

37、在一个实施方案中，该测定法进一步包括以下一种或多种：稳定剂(例如tween20)、缓冲剂(例如pbs)、对照抗体(例如sars-cov-2抗体、sars-cov抗体或正常人igg)、微孔板及其组合。

38、一方面，提供了一种检测样品中sars-cov-2特异性抗体的存在的体外方法，包括使样品与多个如上文定义的纳米传感器进行接触，并检测纳米颗粒聚集的程度。

39、一方面，提供了一种诊断受试者患有sars-cov-2感染的体外方法，包括：

40、通过使来自受试者的样品与多个如上文定义的纳米传感器进行接触来检测该样品中sars-cov-2特异性抗体的存在，

41、检测样品中纳米颗粒聚集的程度，

42、将样品中纳米颗粒聚集的程度与来自未患有sars-cov-2感染的受试者的对照样品中纳米颗粒聚集的程度进行比较，

43、确定与对照样品中纳米颗粒聚集的程度相比，所述样品中纳米颗粒聚集的程度是否更高，从而诊断受试者为患有sars-cov-2感染。

44、一方面，提供了一种治疗经鉴定为患有sars-cov-2感染的受试者的方法，包括：

45、通过使来自受试者的样品与多个如上文定义的纳米传感器进行接触来检测该样品中sars-cov-2特异性抗体的存在，

46、检测样品中纳米颗粒聚集的程度，

47、将所述样品中纳米颗粒聚集的程度与来自未患有sars-cov-2感染的受试者的对照样品中纳米颗粒聚集的程度进行比较，

48、确定与对照样品中纳米颗粒聚集的程度相比，所述样品中纳米颗粒聚集的程度是否更高，从而鉴定受试者为患有sars-cov-2感染；并且

49、向所述受试者施用治疗剂，例如抗病毒剂。

50、在一个实施方案中，治疗剂选自于由下列组成的组，即paxlovidtm(奈玛特韦(nirmatrelvir)和利托那韦(ritonavir))、莫努匹韦(molnupiravir)、氟伏沙明(fluvoxamine)、索托维单抗(sotrovimab)、别布特洛单抗(bebtelovimab)、瑞德西韦(remdesivir)及其组合。

51、在一个实施方案中，纳米颗粒聚集的程度与样品中sars-cov-2特异性抗体的量成正比。

52、在一个实施方案中，可在样品中检测到的sars-cov-2特异性抗体的范围为约3-1000nm，例如约3.2-1000nm。

53、在一个实施方案中，纳米颗粒聚集的结果是可见的颜色变化，例如从红色变为紫色。

54、在一个实施方案中，来自患有sars-cov-2感染的受试者的样品中纳米颗粒聚集的程度大于对照样品中纳米颗粒聚集程度的均值+3个标准差。

55、在一个实施方案中，通过测定a534nm的％变化来检测纳米颗粒聚集的程度，例如通过使用分光光度计或微孔板读数器测量吸光度。

56、在一个实施方案中，a534nm的％变化为约15％至25％或更多，例如20％或更多，表明样品来自患有sars-cov-2感染的受试者。

57、在一个实施方案中，样品是血浆或血清，特别是血浆。

58、定义

59、如本文所用的术语“纳米传感器”指的是一种基于纳米级的装置，其测量物理质量并产生可检测和分析的信号。有不同类型的纳米传感器用于各种应用，最值得注意的是在医学、国防和环境应用中。所有纳米传感器共有相同的基本工作流程：纳米传感器选择性地与分析物结合，根据传感器与分析物的相互作用产生可检测信号，然后可以将其处理成有用的度量。在本公开的上下文中，术语“纳米传感器”通常指的是“纳米生物传感器”或“生物纳米传感器”。

60、如本文所用的术语“生物传感器”指的是设计用于检测或定量生化分子(例如核酸序列，如dna，或者蛋白质、多肽或肽)的装置。

61、因此，可与如本文所用的“生物纳米传感器”互换使用的术语“纳米生物传感器”指的是一种选择性地与生化分子结合并基于该相互作用产生可检测和分析的信号的纳米级装置。

62、如本文所用的术语“纳米颗粒”缩写为“np”，指的是直径尺寸为1至1000nm的任何形状的颗粒，尽管纳米颗粒最常见的尺寸范围为1-100nm。本公开的纳米颗粒可以是球形、基本上球形或非球形的颗粒，例如不规则形颗粒或椭球形颗粒。根据纳米颗粒的形态、尺寸和化学性质，可以将其大致分为不同的类别。一些更广为人知的纳米颗粒类别包括碳基纳米颗粒、金属纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、半导体纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和基于脂质的纳米颗粒。纳米颗粒由于其表面积与质量比大和尺寸小而具有许多独特的性质，这使得它们可以在分子水平上发生相互作用。许多这些性质，例如它们的稳定性、溶解性、化学和/或生物活性，可以通过给它们涂覆上各种物质而改变，这是一个称为官能化的过程。

63、如本文所用的术语“金属纳米颗粒”指的是由纯金属例如金、铂、银、钛、锌、铈、铁和铊、纯金属的组合(例如金和银的合金)或者其化合物如氧化物、氢氧化物、硫化物、磷酸盐、氟化物和氯化物制成的纳米颗粒。在本公开的上下文中，术语“金属纳米颗粒”通常指由纯金属或纯金属的组合制成的纳米颗粒。

64、如本文所用的术语“纳米颗粒聚集”指的是纳米颗粒簇在水性分散体中的形成和生长。这种聚集体或簇包含紧密结合的纳米颗粒集合，使用机械力难以将其分解成原始颗粒。对于许多类型的纳米颗粒而言，谱峰可能由于纳米颗粒聚集状态的变化而发生偏移。“蓝移”指的是向较短波长(即，较高频率、较高能量)偏移的电磁响应。相比之下，红移指的是向较长波长偏移的峰值。例如，金纳米颗粒聚集的结果通常是红移。

65、如本文所用的术语“官能化”指的是通过改变材料的表面化学来为材料增加新功能、特征或性质的过程。因此，当在纳米颗粒的上下文中使用时，“官能化”通常指的是通过将化学物或生物分子缀合到纳米颗粒表面来对该表面进行修饰。有多种官能化的办法，包括非共价结合、共价缀合、无定形纳米颗粒涂覆和表面外延生长。本领域技术人员将了解用于官能化纳米颗粒的一系列合适的办法。

66、如本文所用的术语“钝化作用”指的是对材料进行涂覆，使其变得“钝化”，即不易受周围环境的影响。因此，经过“钝化”的纳米颗粒是其表面涂覆有钝化剂的纳米颗粒。在本公开的上下文中，纳米颗粒的周围环境通常是生物流体。因此，钝化剂是一种适用于钝化纳米颗粒以对抗生物流体的作用剂。

67、如本文所用的术语“肽”泛指通过肽键连接的任何氨基酸残基的链。肽可以是天然存在的或合成的(例如，通过化学合成或重组dna技术产生)。术语“肽”并非暗含特定的大小。在一些示例中，肽可能不包括整个病毒或全长抗原。

68、如本文所用的术语“表位”或“抗原决定簇”指的是由免疫系统的细胞识别，特别是由抗体、b细胞或t细胞识别的抗原的一部分。表位是抗原中与抗体结合的部分。表位通常根据其结构以及与靶抗体的相互作用分为构象表位或线性表位。

69、如本文所用的术语“线性表位”或“线性肽表位”指的是通过其线性氨基酸序列(即通过其一级结构)由免疫细胞所识别的表位。相反，“构象表位”通过其特定的3d形状和结构得到识别。

70、如本文所用的术语“b细胞表位”指的是抗原中与抗体或免疫球蛋白分子结合的部分。因此，如本文所用的术语“b细胞线性肽表位”指的是通过其线性氨基酸序列由抗体或免疫球蛋白分子识别的表位。

71、如本文所用的术语“sars-cov-2”指的是导致新型冠状病毒疾病2019(covid-19)的冠状病毒。sars-cov-2是一种单链rna有包膜病毒。它的整个基因组长度为29,881bp，编码9860个氨基酸。

72、如本文所用的与“刺突蛋白”和“表面糖蛋白”可互换使用的术语“大刺突糖蛋白”，缩写为“s蛋白”，指的是sars-cov-2的刺突蛋白。s蛋白是一种180-200kda的三聚体i类融合蛋白，由两个亚基组成，称为s1和s2亚基。s1亚基(symbol:cov_s1,pfam:pf01600,interpro:ipr002551)由672个氨基酸(s蛋白的残基14-685)组成，并负责通过与人类受体血管紧张素转换酶2(ace2)相互作用介导与宿主细胞的结合。s2亚基(symbol:cov_s2,pfam:pf01601,interpro:ipr002552)由588个氨基酸(残基686-1273)组成，并通过两个七肽重复结构域形成的六螺旋束来介导病毒细胞膜融合。因此，s蛋白在宿主细胞结合和进入中发挥着重要作用。

73、如本文所用的术语“核衣壳蛋白”，缩写为“n蛋白”，指的是sars-cov-2的核衣壳蛋白(symbol:cov-nucleocap,pfam:pf00937,interpof:ipr001218,uniprot:p0dtc9)。核衣壳蛋白在sars-cov-2病毒的转录和复制中发挥着至关重要的作用。

74、s蛋白、s1和s2亚基以及n蛋白的完整氨基酸序列可从sars-cov-2的genbank条目获得，genbank编号mn908947.3。s蛋白氨基酸序列(seq id no:1)在genbank编号qhd43416.1中给出。n蛋白氨基酸序列(seq id no:2)在genbank编号qhd43423.2中给出。

75、如本文所用的与“链霉亲和素-生物素相互作用”可互换使用的术语“生物素-链霉亲和素相互作用”指的是生物素和链霉亲和素之间的非共价相互作用。链霉亲和素是一种从细菌亲和素链霉菌(streptomyces avidinii)中纯化的66kda蛋白质。链霉亲和素同源四聚体对生物素(也称为维生素b7或维生素h)具有极高的亲和力(kd量级为约10-14ml/l)，并且这被认为是自然界中存在的最强非共价相互作用之一。另外，生物素与链霉亲和素和亲和素的结合可以耐受极端高温、ph和蛋白水解，从而可以在多种多样的环境中捕获生物素化的分子。

76、如本文所用的术语“生物素化”指的是将生物素共价附接至蛋白质(如肽)和其他大分子的过程。生物素化快速、特异，并且由于生物素尺寸小(mw＝244.31g/mol)，不太可能干扰分子的天然功能。蛋白质例如肽可以通过化学方式进行生物素化，例如通过使用胺反应性生物素化试剂、巯基生物素化；或者通过酶促方式，例如通过将感兴趣的蛋白质与avitag或受体肽融合。因此，“生物素化肽”是一种已与生物素共价附接的肽。

77、如本文所用的术语“巯基化(thiolyation)”或“巯基化的”指的是将巯基，即-sh官能团附接至蛋白质(例如肽)或其他大分子的过程。作为半胱氨酸的官能团，巯基在生物学中发挥着非常重要的作用。举例来说，当两个半胱氨酸残基的巯基在蛋白质折叠过程中聚在一起时，氧化反应可以生成带有二硫键(-s-s-)的胱氨酸单元。因此，“巯基化肽”是包含巯基的肽。

78、如本文所用的术语“巯基-金属相互作用”与“金属-巯基相互作用”可互换使用，指的是在含巯基分子与金属表面中存在的金属离子之间形成的金属-硫配位/配位键。

79、如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“抗体”指的是包含两条相同的重链和两条相同的轻链的二价y形分子。二硫键将重链和轻链对以及两条重链连接在一起。每条链都包含一个序列可变并负责抗原结合的可变结构域，这些结构域分别称为重链和轻链的vh和vl结构域。每条链还包含至少一个恒定结构域。在轻链中有一个恒定结构域(cl)，而在重链中至少有三个(ch1、ch2和ch3)，有时有四个(ch4)，具体取决于同种型。在人类中，有五种不同类别或同种型的抗体，包括iga(其包括iga1和iga2)、igd、ige、igg(其包括亚类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。

80、如本文所用的术语“sars-cov-2特异性抗体”指的是与sars-cov-2靶抗原，例如sars-cov-2的s蛋白或n蛋白特异性结合的抗体，例如igg。

81、如本文所用的与感染有关的术语“鉴定”应广义地解释为包括确定感染的存在、不存在、量或疾病负担水平。感染可以是处于急性期、康复期早期、康复期晚期、恢复期早期、恢复期晚期、或完全恢复期的感染。

82、如本文所用的与肽有关的术语“衍生的/来源的”意在表示肽的氨基酸序列源自指定的来源，但不一定直接从指定的来源获得。举例来说，“源自sars-cov-2的s蛋白的肽”指的是其氨基酸序列与sars-cov-2s蛋白的一部分或片段相似或相同，或者与多种天然存在的sars-cov-2的共有序列的一部分或片段相似或相同的肽。

83、因此，“来源于s蛋白的肽”可以直接从天然存在的sars-cov-2s蛋白中分离出来，或者更典型地，可以使用sars-cov-2s蛋白的氨基酸序列或多种天然存在的sars-cov-2毒株的共有序列作为原型/参照来合成它。合成可以根据本领域的标准程序进行，例如重组生产技术、基因工程技术或化学合成。“来源于s蛋白的肽”可包含人工氨基酸和非天然氨基酸(例如d-氨基酸、氨基酸类似物等)。在一些实施方案中，“来源于s蛋白的肽”可以进一步包含对源自天然存在的sars-cov-2毒株的氨基酸序列的一个或多个保守性置换。术语“来源于n蛋白的肽”、“来源于s1亚基的肽”或“来源于s2亚基的肽”均应作类似解释。

84、如本文所用的术语“受试者”包括患者和非患者。术语“患者”指的是患有或可能患有医学病况例如黄病毒感染的个体，而“非患者”指的是未患有或可能未患有该医学病况的个体。“非患者”包括健康个体、非患病个体和/或无该医学病况的个体。术语“受试者”包括人类和动物。动物包括鼠类和类似动物。“鼠类动物”指的是来自鼠科的任何哺乳动物，诸如小鼠、大鼠等。

85、如本文所用的术语“治疗(treatment)”、“处理(treat)”和“疗法”及其同义词指的是治疗性处理和预防性或防御性措施，其中目的是防止或减缓(减轻)医学病况，包括但不限于疾病(例如黄病毒感染)、症状和病症。医学病况还包括身体对疾病或病症的应答，如炎症。需要这种治疗的对象包括已经患有某种医学病况的对象，以及易于患上该医学病况的对象或需要预防该医学病况的对象。

86、如本文所用的术语“治疗剂”指的是药物、蛋白质、肽、基因、化合物或其他药学上的活性成分。

87、术语“和/或”，例如“x和/或y”，应理解为表示“x和y”或“x和y”，并且应当视为为两种含义或任一含义提供明确支持。

88、此外，在本文的描述中，无论何时使用的词语“基本上”都应理解为包括但不限于“完整地”或“完全地”等。另外，无论何时使用的术语诸如“包括/包含(comprising)”、“包括/包含(comprise)”等都意在作为非限制性描述语言，因为除了未明确列举的其他组分之外，它们在广义上还包括在这些术语之后列举的要素/组分。例如，当使用“包括/包含”时，提及“一种/个”特征也意在提及该特征的“至少一种/个”。术语诸如“由……组成(consisting)”、“由……组成(consist)”等，在适当的上下文中可视为术语诸如“包括/包含(comprising)”、“包含/包括(comprise)”等的子集。因此，在本文公开的使用术语诸如“包括/包含(comprising)”、“包含/包括(comprise)”等的实施方案中，应当理解的是，这些实施方案为使用术语诸如“由……组成(consisting)”、“由……组成(consist)”等的相应实施方案提供了教导。此外，无论何时使用的术语诸如“约”、“近似”等，通常表示合理的变化幅度，例如所公开值的+/-5％的变化幅度，或所公开值的4％的变化幅度，或所公开值的3％的变化幅度、所公开值的2％的变化幅度或所公开值的1％的变化幅度。

89、而且，在本文的描述中，某些值可以公开为一种范围的形式。显示范围端点的值意在说明优选范围。每当描述了一个范围时，都意味着该范围涵盖并教导了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。也就是说，不应将范围的端点解释为硬性限制。例如，对1％至5％范围的描述意在已明确公开了子范围1％至2％、1％至3％、1％至4％、2％至3％等，以及单独公开该范围内的值，例如1％、2％、3％、4％和5％。应当理解，该范围内的单个数值还包括整数、分数和小数。而且，每当描述了一个范围时，还意味着该范围涵盖并教导了从所示数字端点起至多2个附加小数位或有效数字的值(在适当情况下)。例如，对1％至5％范围的描述意在已明确公开了1.00％至5.00％还有1.0％至5.0％的范围，以及跨越这些范围的所有其中间值(例如1.01％、1.02％…4.98％、4.99％、5.00％和1.1％、1.2％...4.8％、4.9％、5.0％等)。上述明确公开的意图适用于任何深度/宽度的范围。

90、如本文所用的“至少95％同一性”意指在其全长上与参照序列具有95％或更高同一性的氨基酸序列，例如96％、97％、98％或99％同一性。可以采用软件程序来计算同一性百分比。

91、另外，在描述一些实施方案时，本公开可以将方法和/或过程公开为一系列特定的步骤。然而，除非另有要求，否则应当理解，该方法或过程不应局限于所公开的该系列特定的步骤。其他系列的步骤也是可能的。本文公开的特性顺序的步骤不应该被理解为过度限制。除非另有要求，本文公开的方法和/或过程不应局限于按照书面顺序执行的步骤。该系列步骤可能会有所不同，并且仍然处于本公开的范围内。

92、而且，应当理解的是，尽管本公开提供了具有本文所论述的一种或多种特征/特性的实施方案，但是这些特征/特性中的一种或多种也可能在其他备选实施方案中被否定，并且本公开为此类否定和这些相关的备选实施方案提供支持。