新型生物标志物的制作方法

本发明涉及出于预后疾病发展的目的并且具体地出于预测癌症患者对免疫疗法的反应和评价癌症患者的存活时间的目的的细胞群体的检测和分析的领域。

背景技术：

1、癌症是全世界主要的死亡原因，并且据估计2017年有约960万人死于癌症。随着由于对其它死因治疗的发展所带来的预期寿命的提高，癌症病例数缓慢增长。因此，持续需要用于评价癌症的新方法以告知患者和护理人员两者患者个体疾病的状态和未来存活前景。

2、恶性肿瘤的tnm分类系统(brierly等人，2017)提供了描述癌症和对癌症分期的国际统一标准，其隶属于国际抗癌联盟(uicc)发表。

3、已提议了以商品名(在本公开中，有时缩写为“is”)可商购的免疫打分系统，其评价常规切除的肿瘤中肿瘤中心区中和侵袭边缘处的cd3+和cd8+t细胞的丰度(galon等人，2006)。它最近还被验证作为除其它临床参数，包括t和n期外的结肠癌i-iii期中的独立预后因子(pagès等人，2018)。尽管在结直肠癌中的有效性得到证实，但是仍缺少它在其它肿瘤类型中的预后显著性的强力证据。

4、已表明cd163+肿瘤浸润巨噬细胞和cd8+细胞是骨肉瘤中的关键性预后生物标志物(gomez-brouchet等人，2017)。已发现cd68和cd163染色的存在是高度相关的，据发现这表明可能存在常见的巨噬细胞亚组。解释结果表明cd163和cd68的高水平与更好的整体存活期和无转移发展存活期关联。作者还发现患者样品间的cd8+染色水平较低，其中值染色为1％。尽管在超过一半的患者样品中检测到cd8+细胞，但是在诊断时它们的存在与较低的转移率显著关联。尚未研究cd8+、cd163+和cd68+细胞的定量测量之间的关系。

5、wo2016/134416公开了提供患有弥漫性大b-细胞淋巴瘤的受试者对治疗方案起反应的预后的方法，该方法包括：基于受试者中cd137、cd4、cd8、cd56、tnfα(α)和lmo2中的任何一种或多种的水平与受试者中的pd-1、pd-l1、cd163、cd68、pd-l2、lag3、tim3和scya3(ccl3)中的任何一种或多种的水平之比，确定受试者的免疫得分，将免疫得分与参考得分相比较；其中与参考得分相比的免疫得分指示了受试者对治疗方案起反应的预后。wo2016/134416中公开的特异性免疫得分全部定义了比例，该比例在分子中包括了多种标志物水平，并且所有所指明的免疫得分引入了pd-1或pd-l1。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供用于评价多种癌症形式的替代和改善的生物标志物，并且具体地提供用于预后诊断患有癌症的受试者的存活时间的方法。

2、因此，在第一方面，本发明涉及用于预测诊断患有癌症的受试者对免疫疗法的反应或者预后诊断患有癌症的受试者的存活时间的体外方法，包括：

3、-在受所述癌症影响的组织中，测量由对cd8呈阳性的细胞组成的第一细胞类别的第一密度d1和由对以下中的至少一种呈阳性的细胞组成的第二细胞类别的第二密度d2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，

4、-确定d1和d2之间的关系；和

5、-将所确定的关系与预测所述受试者对免疫疗法的反应或指示所述受试者的存活时间的至少一个预定参考值相比较。

6、在一个实施方式中，该方法包括

7、-从该受试者获得癌组织样品；

8、-在该组织样品中，测量由对cd8呈阳性的细胞组成的第一细胞类别的第一密度d1和由对以下中的至少一种呈阳性的细胞组成的第二细胞类别的第二密度d2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，

9、-确定d1和d2之间的关系；

10、-将所确定的关系与指示所述受试者的存活时间的至少一个预定参考值相比较；和

11、-基于该比较确定受试者对免疫疗法的反应的预测以及受试者的存活时间的预后。

12、在一个实施方式中，通过以下确定用于预测受试者对免疫疗法的反应的预定参考值：

13、-在来自诊断患有所述癌症并且对免疫疗法具有已知反应的受试者群组中每位受试者的癌组织样品中，测量由对cd8呈阳性的细胞组成的第一细胞类别的第一密度d1和由对以下中的至少一种呈阳性的细胞组成的第二细胞类别的第二密度d2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，

14、-确定d1和d2之间的关系；

15、-将所确定的关系与受试者的已知存活时间相比较以获得该关系与存活时间之间的关联；和

16、-确定参考值以预测诊断患有癌症的受试者对免疫疗法的反应。

17、在一个实施方式中，通过以下确定用于预后受试者的存活时间的预定参考值：

18、-在来自诊断患有所述癌症并且具有已知存活时间的受试者群组中每位受试者的癌组织样品中，测量由对cd8呈阳性的细胞组成的第一细胞类别的第一密度d1和由对以下中的至少一种呈阳性的细胞组成的第二细胞类别的第二密度d2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，

19、-确定d1和d2之间的关系；

20、-将所确定的关系与受试者的已知存活时间相比较以获得该关系与存活时间之间的关联；和

21、-确定参考值以指示诊断患有癌症的受试者的存活时间。

22、在一个方面，测量受癌症影响的组织样品中的相对细胞密度的方法包括以下步骤：测量组织样品中由对cd8呈阳性的细胞组成的第一细胞类别的第一密度d1和组织样品中由对以下中的至少一种呈阳性的细胞组成的第二细胞类别的第二密度d2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，以及计算d1和d2之间的关系。

23、在一些实施方式中，第二细胞类别由对cd68和cd163两者呈阳性的细胞组成。

24、在一些实施方式中，第二细胞类别由对c1qa、c1qb和c1qc中的至少一种以及任选地cd68呈阳性的细胞组成。

25、在一些实施方式中，d1和d2之间的关系的确定包括计算比率d1/(d1+d2)或d1/d2或者它们的倒数。

26、在一些实施方式中，癌症选自结直肠癌、膀胱癌、肺癌、黑色素瘤和胃食管腺癌。

27、在一些实施方式中，将计算的比例与确定受试者的存活时间的预后的至少一种临床风险因子组合。

28、在一些实施方式中，至少一种临床风险因子选自由以下组成的组：受试者的性别、微卫星不稳定性状态、肿瘤偏侧性、t期、n期、肿瘤分化。

29、在一些实施方式中，通过分析基因表达进行细胞密度的测量。

30、在一些实施方式中，通过以下进行细胞密度的测量：对分析的组织区域中对cd8呈阳性的细胞以及对以下中的至少一种呈阳性的细胞计数：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合，以及任选地针对分析的组织区域的尺寸进行归一化。

31、在一些实施方式中，分析的组织区域包括肿瘤中心和侵袭边缘两者。

32、在一些实施方式中，通过用对待检测的cd8、cd68、cd163、c1q、c1qa、c1qb或c1qc特异的可检测抗体对组织染色来帮助细胞计数。

33、在一个方面，本发明涉及用于预测诊断患有癌症的受试者对免疫疗法的反应或者预后诊断患有癌症的受试者的存活时间的体外方法，包括：

34、a)在受该癌症影响的组织中，测量选自由cd8和编码它的rna分子组成的组中的第一组分子的第一浓度c1和选自由以下组成的组中的第二组分子的第二浓度c2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合；以及编码它们的rna分子；

35、b)确定c1和c2之间的关系；和

36、c)将所确定的关系与预测所述受试者对免疫疗法的反应或指示所述受试者的存活时间的至少一个预定参考值相比较。

37、在一些实施方式中，该方法包括

38、-从所述受试者获得癌组织样品；

39、-进行根据权利要求16的方法的步骤a)-c)；和

40、-基于该比较确定受试者对免疫疗法的反应的预测以及受试者的存活时间的预后。

41、在一些实施方式中，其中该方法用于预测受试者对免疫疗法的反应，通过以下确定预定参考值：

42、-在受所述癌症影响的组织中，测量选自由cd8和编码它的rna分子组成的组中的第一组分子的第一浓度c1和选自由以下组成的组中的第二组分子的第二浓度c2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合；以及编码它们的rna分子；

43、-确定c1和c2之间的关系；和

44、-将所确定的关系与受试者的已知存活时间相比较以获得该关系与存活时间之间的关联；和

45、-确定参考值以预测诊断患有癌症的受试者对免疫疗法的反应。

46、在一个方面，该方法涉及测量受癌症影响的组织样品中相对分子浓度的方法，该方法包括以下步骤：测量组织样品中选自由cd8和编码它的rna分子组成的组中的第一组分子的第一浓度c1和组织样品中选自由以下组成的组中的第二组分子的第二浓度c2：c1q；cd68和cd163的组合；以及cd68和c1q的组合；以及编码它们的rna分子；以及计算c1和c2之间的关系。

47、在一些实施方式中，第二组分子由cd68和cd163或者编码它们的rna分子组成。

48、在一些实施方式中，第二组分子由c1qa、c1qb和c1qc中的至少一种以及任选地cd68或者编码它们的rna分子组成。

49、在一些实施方式中，c1和c2之间的关系的确定包括计算比率c1/(c1+c2)或c1/c2或它们的倒数。

50、在一些实施方式中，癌症选自结直肠癌、乳腺癌、胰十二指肠癌、膀胱癌、肺癌、黑色素瘤和胃食管腺癌。

51、在一些实施方式中，将所确定的关系与确定受试者的存活时间的预后的至少一种临床风险因子组合。

52、在一些实施方式中，至少一种临床风险因子选自由以下组成的组：受试者的性别、微卫星不稳定性状态、肿瘤偏侧性、t期、n期、肿瘤分化。

53、在一些实施方式中，通过整体rna测序进行浓度的测量。