用于检测分析的多重标记的聚合物构建体的制作方法

本发明涉及用于检测特定生物分子的量，例如蛋白质或核酸的方法、试剂盒和设备。本发明特别涉及在基于流动的分析设备上进行的技术。生物分子的存在与否可以在使用光学读数的设备上来检测。

背景技术：

1、当在工作中检测生物分子时，使用简单的仪器准确地检测尽可能少的分子的拷贝是有利的。虽然可以扩增核酸样品以增加特定序列的浓度，但抗体、蛋白质或其他非核酸生物分子不能被扩增，因此检测受到样品中出现的此类分子数量的限制。

2、核酸扩增技术通常需要某种形式的硬件来确保扩增发生。通常还需要引入额外的试剂。在需要快速且廉价地读出样品中特定生物分子存在与否的情况下，这两种情况都不理想。

3、当进行遗传分析时，通常需要扩增样品中的拷贝数，因为样品中存在的拷贝数通常太少而无法检测到。这可以使用例如热循环或等温扩增来完成。已经开发了pcr和等温碱基扩增方法来检测少量的dna或rna。然而，这种方法可能需要约90分钟才能产生结果。

4、热循环分析需要用于加热和冷却的硬件以及用于检测扩增产物的存在的装置。

5、等温扩增技术包括sda、lamp、smap、hda、expar/near、rpa、nasba、ican、smart。该反应利采用链置换反应在恒温下进行。扩增可以在一个步骤中通过在恒温下孵育样品、引物、具有链置换活性的dna聚合酶和底物的混合物来完成。这种方法通常在15-60分钟内扩增核酸的拷贝至少109倍。然而，仍然需要一种检测扩增的材料的存在的装置。基于标准pcr的扩增在36个循环(90-120分钟)后，可以检测每个反应1-10个分子。等温扩增可以实现与基于pcr的技术相似的性能。

6、核酸被扩增之后，核酸分析需要二次检测技术，例如分光光度法或浊度法。然而，这些已知的技术具有缺点。荧光检测需要标记以使得产生荧光，这使得它很昂贵。试剂sybr绿与dna结合，使其具有内在的致癌性；埃姆斯(ames)试验显示其既有致突变性又有细胞毒性。sybr也不是特异性的，它附接在任何双链dna上，从而增加背景信号。浊度测量需要昂贵的仪器来提供定量。

7、在检测非核酸的情况下，例如血液蛋白质的存在，分析的灵敏度取决于样品中蛋白质分子的数量。样品中蛋白质分子的数量不能增加。

8、一种常见的分子检测技术是横向流动分析，其中通过载体上的抗体相互作用来识别分子。横向流动分析是众所周知的，并且已经在各种分析平台中使用了几十年，例如家庭妊娠测试。基本流动分析已被用于开发临床、兽医、环境、农业、生物防御和食源性病原体筛选应用的大量分析。条带分析具有广泛的适应性，因此可商业化适用于广泛的分析物，包括血液蛋白生物标记物、真菌毒素、病毒和细菌病原体，以及一系列核酸检测产品。然而，由于没有进行扩增，这种分析受限于所需样品的量。这种分析没有扩增系统，因此只有当测试溶液中存在足够量的检测分子时，分析才有效。

9、自20世纪80年代引入以来，横向流动技术已经成为护理点和家庭测试的重要工具。它们通常用于检测广泛的目标，例如hcg、传染病和滥用药物，并且在兽医测试、环境测试和监测与人类生理状况相关的分析物中也很常见。初始测试提供了阳性/阴性结果，但是读取器技术的发展以及材料和试剂的改进使得半定量和定量分析的进展成为可能。

10、横向流动分析本质上是免疫分析，其已经被调整为沿着单个轴操作，以适应测试条的格式。已经存在许多开发成商业化产品的技术的变体，但是它们通常采用相同的基本概念来操作。该技术基于一系列毛细管床，例如多孔纸或聚合物。这些要素中的每一个都具有运输流体，例如体液(例如血液、唾液或尿液或它们的提取物)的能力。典型的横向流动分析测试条通常由以下成分组成：

11、1.样品垫

12、将测试样品施加在其上的吸附垫。这就像一块海绵，可以容纳过量的样品液体。

13、2.结合物垫或试剂垫

14、样品垫饱和之后，流体迁移到多孔结合物垫，该结合物垫包含特异于与有色颗粒(通常是金纳米颗粒或乳胶微球，但在某些情况下使用荧光标记)结合的目标分析物的抗体。当样品流体分散基质时，它也溶解颗粒，并且在一个组合的输送动作中，样品和结合物混合物流过多孔结构。这样，分析物结合到颗粒上，同时沿着测试条进一步迁移。

15、3.反应膜

16、这通常是一种膜，抗靶标分析物抗体以条带状被固定在其上，该条带穿过膜以作为捕获区或测试线(也将存在控制区，其包含特异于结合抗体的抗体)。

17、反应膜具有一个或多个固定了第三分子的区(条带)。当样品-结合物混合物到达这些条带时，分析物已经结合在颗粒上，条带中的第三个“捕获”分子结合复合物。一段时间后，当越来越多的液体通过条带时，颗粒积聚，条带-区改变颜色。通常至少有两个条带：一个(对照)捕获任何颗粒，从而表明反应条件和技术运行良好，第二个包含特定的捕获分子，并且仅捕获分析物分子已经固定在其上的那些颗粒。

18、4.芯子或废物容器

19、额外的吸收垫，设计用于通过毛细作用将样品吸过反应膜。通过测试条带之后，流体进入最终的多孔材料，该多孔材料只是作为废物容器。

20、测试条带的成分通常固定在惰性背衬材料上，并且可以以简单的试纸形式呈现，或者在带有样品端口和显示捕获和控制区域的反应窗口的塑料外壳内呈现。

21、测试条带的灵敏度受限于测试溶液中材料的含量。目标分析物的一个分子释放一个抗体结合物，该抗体结合物附接在一个可检测的有色颗粒上。因此，分析的灵敏度受限于原始样品中的目标的浓度。如果样品中生物分子的浓度太低，这种分析容易出现假阴性读数。

技术实现思路

1、本发明涉及用于提高横向流动分析的检测灵敏度的方法和设备。现有技术的分析在灵敏度上是有限的，因为只有一个可检测的部分与每个样品分子连接。本发明允许每个单独样品分子有多个可检测部分被捕获，从而增加了可直接检测信号的水平。

2、通过结合本身具有多个结合位点的配体以产生分支结构来放大信号的概念已被用于各种技术中。例如ep0354847的图1，其中afp为α-甲胎蛋白，b为生物素，sa为链霉亲和素，以及tg为甲状腺红蛋白：

3、

4、最终目标是为金缀合物产生尽可能多的结合位点，以结合这些位点，将它们束缚在检测区。

5、申请人已经开发了改进的结合物，以用于分析，包括横向流动分析。通过以不同于上述技术的方式生产该结构，申请人可以产生比现有技术的方法可能产生的更高水平的信号放大。此外，它可以用于更多的情况，因为它不需要抗体/配体经历进一步的化学处理。

6、现有技术的方法依赖于生物素化抗体的使用来扩大信号(例如专利wo 00/25135和专利ep0354847a2中的情况)。基本上，抗体/配体必须用生物素处理并包被生物素。这种nhs-生物素连接的工艺有许多缺点。它需要蛋白质经历可以抑制或降低它们的结合功能的过程。此外，它依赖于蛋白质表面能够与化学连接子(nhs-生物素)反应的反应基团的可用性，这限制了可以附接而不影响抗体的功能的基团的数量。

7、本公开提供了分析系统中信号放大的改进方法。

8、本公开的第一方面提供了第一噬菌体衣壳，该第一噬菌体衣壳具有多种病毒外壳蛋白，其中至少第一比例的外壳蛋白包括亲和肽，该亲和肽包括特异于结合配偶体的亲和标签的多个拷贝。结合配偶体可以结合到可检测标志物上，例如纳米颗粒。

9、第一噬菌体衣壳还可以包括偶联到衣壳表面的特异于靶标(例如抗体)的区域。这样，当单个靶标与该区域结合时，显示噬菌体衣壳上产生的亲和肽的多个拷贝。由于亲和肽携带亲和标签的多个拷贝，亲和肽吸引可检测标志物的多个拷贝。这提供了信号的显著放大。

10、使用第二噬菌体衣壳可以进一步扩大。该第二衣壳配置为通过标签/粘合子(tag/binder)相互作用结合第一衣壳。衣壳还具有多种病毒外壳蛋白，其中至少第一比例的外壳蛋白携带特异于在第一衣壳上存在的亲和标签的结合配偶体，第二比例的衣壳蛋白携带包含第二亲和标签的多个拷贝的亲和肽。该第二亲和标签可以是特异于与可检测标志物结合的结合配偶体的。以这种方式，扩大比第一种方法显著增加，因为更多可检测的标记物与单个靶标相连接。该第二衣壳提供了本公开的另一实施方式。

11、在一些实施方式中，(b)的结合配偶体配置为结合权利要求2的噬菌体衣壳的亲和标签。

12、第二衣壳优选地缺少特异于靶标的区域。

13、当然，亲和标签/结合配偶体对可以在每种情况下互换，使得第一衣壳携带结合配偶体，而标记物或第二衣壳携带肽标签。

14、第二衣壳和第一衣壳可配置为通过肽标签和结合配偶体之间的相互作用结合在一起。

15、方便的是，由于许多噬菌体的基因组编码一种以上的外壳蛋白，各种亲和肽和结合配偶体可以表达为不同种类外壳蛋白的构建体(例如融合体)。这样，通过选择合适的衣壳和外壳蛋白，一种结合物或标签与另一种结合物或标签的比例可以改变。

16、本文描述了一种产生具有小标签的多个亚基的融合(衣壳)蛋白的方法，该小标签随后将作为其它特异性标签/抗体的对接位点(实例包括his(hhhhhh)、flag(dykddddk)、e标签(gapvpypdplepr)、ha(ypydvpdya)、strept标签(wshpqfek)、myc(eqkliseedl)、s标签(ketaaakferqhmds)、sh3(stvpvapprrrrg)、g4t(eellsknyhlenevarlkk)。产生这些融合蛋白而不是用诸如生物素的因子处理蛋白具有许多优点，包括但不限于：

17、1.它不需要抗体经过进一步的可以抑制它们的功能的处理。

18、2.它允许控制标签的位置，从而不抑制抗体的功能。

19、3.更多的标记可以被引入到每个融合蛋白中而不抑制功能。

20、4.通过引入寡聚化肽，这允许每个结合蛋白亚基携带4-7倍的标签的量。(例如，igg抗体可以携带约2-10个生物素分子。融合蛋白从5-10个重复亚基开始，然后寡聚成亚基，每个亚基具有25-70个标签。现有技术的分支将信号放大2-10倍。本文描述的每种蛋白质将信号放大25-70倍。

21、还描述了使用本文所述的衣壳结构来增加可用信号的方法。衣壳是自折叠蛋白质结构的多蛋白质组装体。衣壳是病毒或噬菌体的蛋白质外壳，包裹着其遗传物质。它由蛋白质构成的寡聚(重复)结构亚基组成。构成衣壳的蛋白质被称为衣壳蛋白或病毒外壳蛋白(vcp)。衣壳可以在所有噬菌体中找到，包括例如t7、m13。

22、任何噬菌体衣壳都可以如本文所述进行改造，例如m13、t4、mu、p1、p2、λ、t5、hk97、n15、t7、t3、和p22。

23、本文还描述了“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”是感染细菌或古生菌并在细菌或古生菌内复制的病毒。噬菌体宝包括包裹dna或rna基因组的蛋白质。基因组可以编码多个基因(少至四个基因，例如ms2，多至数百个基因)。噬菌体在将它们的基因组注射到细菌的细胞质后在细菌内复制。噬菌体结构由衣壳头、颈圈和噬菌体尾组成。

24、本文还描述了包括衣壳蛋白的多蛋白组装体的第一噬菌体衣壳，该多蛋白组装体包括多个单元，所述单元仅为：

25、(i)包括重复氨基酸序列的肽，该重复氨基酸序列为特定结合配偶体的亲和标签；这些亲和标签可以配置为结合到第二病毒衣壳或可检测纳米颗粒上的特定结合配偶体；或

26、(ii)所述亲和标签的特定结合配偶体。这些特定结合配偶体可配置为结合到第二病毒衣壳或可检测纳米颗粒上的亲和标签；和

27、其中，该第一病毒衣壳额外地包括特异于样品中的靶标的区域。

28、在一些实施方式中，第一噬菌体衣壳包括衣壳蛋白的多蛋白组装体，该多蛋白组装体包括多个肽，该多个肽包括重复氨基酸序列，该重复氨基酸序列是特定结合配偶体的亲和标签；这些亲和标签可配置为结合到第二病毒衣壳或可检测标志物上的特定结合配偶体；其中，该第一噬菌体衣壳额外地包括特异于样品中的靶标的区域。

29、本文还描述了第二噬菌体衣壳。该第二噬菌体衣壳可配置为通过标签/粘合子相互作用结合第一衣壳。第二噬菌体衣壳包括衣壳蛋白的多蛋白组装体，该多蛋白组装体包括两个不同单元，每个单元为下述各项中的一项：

30、(a)包括肽的衣壳蛋白，该肽包括特异于肽或蛋白质结合配偶体的肽亲和标签的至少两个重复序列；或

31、(b)包括特异于肽亲和标签的肽或蛋白质结合配偶体的肽序列的衣壳蛋白。

32、这提供了两种不同类型的单元的族群。

33、第二噬菌体衣壳优选地缺少特异于样品中的靶标的区域。

34、在一些实施方式中，肽亲和标签特异于第一衣壳上的肽或蛋白质结合配偶体的蛋白质序列和/或肽的肽序列，或者蛋白质结合配偶体特异于第一衣壳上的肽亲和标签，以存在者为准。

35、在一些实施方式中，噬菌体衣壳具有(a)和/或(b)中的两个或多个，前提是亲和标签在每种情况下是不同的。在一些实施方式中，衣壳具有(a)中的至少一个和(b)中的至少一个，或者可以具有(a)中的至少两个或(b)中的至少两个，例如，特别是(a)中的一个和(b)中的一个。

36、本文还描述了第一多重标记的蛋白衣壳构建体，该第一多重标记的蛋白衣壳构建体包括特异于靶标的区域，以及作为特异于可检测纳米颗粒的亲和结合位点的重复氨基酸序列，该构建体具有至少两个单独的亲和结合位点，每个亲和结合位点配置为连接到单独的可检测纳米颗粒。

37、本文还描述了第二多重标记的蛋白衣壳构建体，该第二多重标记的蛋白质衣壳构建体包括(i)作为特异于可检测纳米颗粒的亲和结合位点的重复氨基酸序列，(ii)特异于第一衣壳上的肽亲和标签的肽或蛋白质结合配偶体的多个肽序列，该构建体具有至少两个单独的亲和结合位点，每个亲和结合位点配置为连接到单独的可检测纳米颗粒。

38、上述两种嵌合衣壳一起还提供了扩增对，该扩增对提供的扩增水平优于使用包括特异于靶标的区域的单个嵌合衣壳和亲和标签的多个拷贝所获得的扩增水平。

39、本文还描述了多重标记的蛋白衣壳构建体，该多重标记的蛋白衣壳构建体包括作为特异于可检测纳米颗粒的亲和结合位点的重复氨基酸序列，该构建体具有至少两个单独的亲和结合位点，其独立地连接到单独的可检测纳米颗粒。

40、每个衣壳可以包括一个特异于靶标的区域。这种排列使得单个靶标分子能够携带大量的衣壳和纳米颗粒，从而提高检测的灵敏度。

41、因此，衣壳结构包含或包括多个蛋白质链(本文称为衣壳蛋白(cp)、病毒外壳蛋白(vcp)或蛋白质折叠股)，每个链具有多个标记。衣壳结构允许组装该结构，使得亲和结合位点或结合配偶体呈现在衣壳的外部。

42、在一些实施方式中，单个衣壳蛋白可以表达具有多个标签，通常以包括多个相同标签的肽(“亲和肽”)的形式，附接到n末端或c末端(特别是c末端)。可选地，该表达可以将化学上可修饰的或反应性的基团连接到衣壳蛋白的n末端或c末端(特别是c末端)，这允许包括多个标签的肽化学地结合到衣壳蛋白的n末端或c末端，优选的c末端。同样的两种方法可用于提供肽或蛋白质结合配偶体。

43、不同类型的病毒的衣壳具有不同数量的衣壳蛋白。一些衣壳具有多种衣壳蛋白。典型的衣壳可能每个衣壳具有数百个衣壳蛋白。因此，如果每个衣壳蛋白具有5-10个标签，并且每个衣壳具有200-500个衣壳蛋白，则通过单次标记获得每个衣壳1000-5000的信号放大。

44、衣壳可以在一种或多种外壳蛋白中具有多个亲和标签。每个衣壳蛋白可以包括2个或更多个亲和标签，它们通常可以作为亲和肽串联排列。可选地，衣壳可以被改造为包含或包括多个反应位点，使得多个亲和标签或亲和肽能够化学附接。反应位点可以是赖氨酸或另一种反应性氨基酸，例如半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和/或组氨酸。

45、还描述了一种制备多重标记的蛋白衣壳构建体的方法，该方法包括：

46、(i)取含有多个活性氨基酸亚基的多蛋白衣壳；

47、(ii)将多个重复氨基酸序列或作为特异于可检测纳米颗粒或特异于进一步嵌合衣壳的亲和结合位点的亲和标签化学连接到反应性氨基酸亚基；以及可选地

48、(iii)将多个可检测的纳米颗粒结合到亲和结合位点。

49、衣壳含有多种衣壳蛋白，其中两种或更多的衣壳蛋白，优选地所有衣壳蛋白或者一类衣壳蛋白的所有衣壳蛋白含有反应性氨基酸。反应位点可以是赖氨酸或另一种反应性氨基酸，例如半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、组氨酸。组装成衣壳后，衣壳可以化学连接到亲和肽或者其他标签上。亲和标签也可以是小分子标签，例如生物素。化学修饰是特异于衣壳表面的，不会导致标签的随机化学附接，从而导致蛋白质变性或功能丧失。

50、衣壳蛋白自组装形成衣壳结构。蛋白质衣壳可以在室温下长时间储存。衣壳也可以冻干并且作为干燥材料保存。与其他蛋白质结构不同，衣壳可以再水合而不会显著变性或失去功能。

51、衣壳可以以分支结构链接在一起。因此，构建体可以包括两种或多种衣壳。第一衣壳可以结合到靶标上，第二衣壳可以结合到纳米颗粒上。第一衣壳可以结合到多个第二衣壳，并且每个第二衣壳结合到多个纳米颗粒。

52、本文还描述了一种产生融合衣壳蛋白的方法，该融合衣壳蛋白包括重复氨基酸的多个亚基，然后作为化学连接的位点(例如本文所述的亲和肽)。如本文所述，连接可以附接特定的标签和/或抗体和/或其他蛋白质或肽。产生这些具有以重复氨基酸作为连接位点的肽链的融合蛋白允许将蛋白衣壳构建体连接到任何现有的蛋白和非重组抗体(不作为衣壳蛋白融合体产生的抗体)。因此，可以制备单个衣壳用于任何系统，以连接任何现有的蛋白质和非重组抗体。例如，衣壳可以用生物素标记。可选地，衣壳可以用重复氨基酸结合基序(例如在亲和肽上)标记。在生物素或氨基酸基序的情况下，多个颗粒标记可以附接在每个衣壳上。

53、本文描述了一种使用本文所述的标记的衣壳在短时间内检测少量靶标分子的方法。因此，样品中的每个靶标分子都用多个纳米颗粒标记，从而增加了从样品中每个分子获得的信号。

54、多个结合位点位于或附接于衣壳蛋白的特定位点，而不是作为诸如生物素的附属物随机附接。因此，可以精确地设计和控制标签的位置和数量。该位置允许标签的优化结合，以最大化获得的信号。

55、本文还描述了一种使用本文所述的标记衣壳在短时间内检测少量目标分子的方法，本文所述的标记衣壳特异性结合到靶标以及结合到(i)多个可检测标志物，例如纳米颗粒，或者结合到(ii)额外的标记的衣壳(如本文所述)，其中额外的标记的衣壳特异性结合到第一标记的衣壳和多个可检测标志物。

56、本文描述的技术涉及一种聚合物分子构建体，该聚合物分子构建体包括特异于靶标的区域，该聚合物分子具有多个亲和结合位点，其中至少两个亲和结合位点配置为结合到可检测的纳米颗粒上。

57、本文描述的技术还涉及一种聚合物分子构建体，该聚合物分子构建体包括特异于靶标和多个可检测纳米颗粒的区域，该聚合物分子还具有多个亲和结合位点，其中至少两个亲和结合位点各自独立地连接到可检测纳米颗粒。

58、本文描述的技术进一步涉及一种多重标记的多蛋白衣壳构建体，该多重标记的多蛋白衣壳构建体包括特异于靶标和多个可检测纳米颗粒的区域，该构建体具有多个亲和结合位点，其中至少两个亲和结合位点各自独立地连接到可检测纳米颗粒。

59、本文描述的技术进一步涉及一种多重标记的多蛋白衣壳构建体，该多重标记的多蛋白衣壳构建体包括特异于靶标的区域，该构建体还包括多个亲和结合位点，其中至少两个亲和结合位点各自独立地可连接到可检测纳米颗粒或连接到第二多重标记的多蛋白衣壳构建体，该第二多重标记的多蛋白衣壳构建体包括多个亲和结合位点，其中至少两个亲和结合位点各自独立地可连接到可检测纳米颗粒。

60、本文描述的技术进一步涉及一种用于检测靶标的存在的流动设备，该设备包括：

61、(a)位于该横向流动设备的一端的样品上样区；

62、(b)包括多重标记的蛋白衣壳构建体的区，该多重标记的蛋白衣壳构建体包括特异于靶标的区域和作为特异于可检测纳米颗粒的亲和结合位点的重复氨基酸序列，该构建体具有独立地连接到可检测纳米颗粒的至少两个单独的亲和结合位点，其中该构建体能够芯吸穿过该横向流动设备的至少部分；

63、(c)包括针对特定靶标的捕获探针和针对聚合物分子构建体的捕获探针的区，其中该捕获探针固定在该横向流动设备上；和

64、(d)吸收材料，其中当水性样品添加到样品上样区时，该吸收材料将水性样品芯吸穿过该横向流动设备。

65、本文描述的技术还涉及一种用于检测样品中靶标的存在的流动设备，该设备包括：

66、(a)位于该流动设备的一端的样品上样区；

67、(b)包括多重标记的蛋白衣壳构建体的区，该多重标记的蛋白衣壳构建体包括特异于靶标的区域和作为特异于可检测纳米颗粒的亲和结合位点的重复氨基酸序列，该构建体具有独立地连接到可检测纳米颗粒的至少两个单独的亲和结合位点，其中该构建体能够芯吸穿过该横向流动设备的至少部分；

68、(c)包括针对特定靶标的捕获探针的区，其中该捕获探针固定在该横向流动设备上；和

69、(d)吸收材料，其中当水性样品添加到样品上样区时，该吸收材料将水性样品芯吸穿过该横向流动设备。

70、该设备可以采取测试条带的形式，其中流体沿着单个轴流动。该设备也可以称为芯片，其中条带包含在保持器内，以便帮助处理条带。检测靶标所需的所有化学品和试剂都固定在固体支持物表面上，然后将其暴露于被测试靶标的流体中。

71、在另一种方法中，本文所述的衣壳、多重标记的聚合物分子构建体或标记的蛋白质构建体可以在应用于横向流动设备之前与样品混合。在这种设备中，设备不需要包含(b)中描述的区。

72、流动分析可以是横向流动分析，其中流体沿着多孔材料的条带流动，或者是垂直流动分析，其中流体在重力或毛细作用下通过各个部分。垂直流动和横向流动可以结合。

73、检测可以在不需要任何溶液试剂的情况下进行，因为所需的一切都可以固定在设备的表面上。特定的应用涉及生物分子的鉴定，例如蛋白质、抗体或核酸分子。除了与样品混合、固定或附接在条带上的酶或分子之外，不需要额外的酶或分子。例如，该技术允许检测rna而不需要逆转录酶，允许检测dna而不需要基于聚合酶的扩增，以及允许检测蛋白质而不需要酶或其底物。因此，它允许检测少量分子，例如蛋白质、脂质、糖、代谢物、小分子和化学物质。

74、靶标可以是需要检测的任何分子。靶标可以是蛋白质。靶标可以是抗体。靶标可以是脂蛋白。靶标可以是小分子。靶标可以是核酸。靶标可以是dna、rna或它们的修饰形式。靶标可以直接来源于生物体，例如病毒、细菌或其它病原体。生物体可以是哺乳动物。当靶标是核酸时，该方法允许特定序列的特异性检测，这取决于靶标特异性区域的选择。靶标核酸折叠股可以是单链或双链。在本文所述的标记蛋白构建体中，多个区域可以选自his、flag、e标签、ha、strept标签、myc、s标签、sh3、g4t。