流式细胞仪装置

本发明总体上涉及流式细胞术领域。具体地，本发明涉及基于阻抗的微流控流式细胞仪装置(flow cytometry device)。本发明还涉及使用该流式细胞仪装置来测定颗粒特性的方法。

背景技术：

1、近年来，对从亚微米至微米尺度的各种生物样本的尺寸分布的研究已经引起了人们对广泛的生物医学研究和临床应用的极大关注。例如，细菌的精确尺寸测量(sizing)和计数在抗菌药物敏感性测试和抗菌药物耐药性研究中至关重要。据报道，大多数常见细菌的尺寸分布在亚微米至微米尺度的范围内。除了细菌之外，已经发现从凋亡的细胞裂解的尺寸范围为0.5至5μm的凋亡小体也与免疫调节和肿瘤发生有关。例如，血浆中凋亡小体的尺寸分布与缺血性中风和神经退化性疾病有关；并且t淋巴细胞的凋亡小体促进细胞清除和细胞间通讯。对上述生物样本进行表征和定量需要亚微米精度的精确测量。

2、光学显微术和基于图像的方法是用于微粒尺寸测量和识别的常规技术，然而这些方法费力且耗时。另一种用于微粒尺寸测量和计数的利用光散射进行布朗运动检测的方法已在商业化的纳米颗粒跟踪分析仪(nta)中使用。商业化的nta实现了纳米颗粒检测的高灵敏度和低至纳米尺度的分辨率。然而，由于受限的布朗运动，其表征大颗粒(>1μm)的精确性降低，因此不适合对在亚微米至微米尺度的尺寸范围内的颗粒进行尺寸测量和识别。另外，由于基于光散射的方法对目标的运动敏感，因此难以探测具有自移动性的活体生物样本(例如，活菌)。

3、微流控流式细胞术由于其单颗粒水平表征、高通量和所需测试样本量少的优点，已成为微粒尺寸测量、计数和识别的理想候选。例如，高通量颗粒表征已被证明可用于抗菌药物敏感性测试和细胞生物物理表型。为了进行单颗粒/细胞表征，流式细胞术中微流控通道的截面尺寸通常设计在μm的范围内。这种限制使得在微流控通道中能够逐个分析颗粒。当前商业化的流式细胞术主要是基于激光的，其利用激光束来询问单个微粒。微粒的尺寸可以使用前向散射通过检测有多少光被微粒阻挡来测定。由于流式细胞术中微流控通道的限制，在微流控流式细胞术中可以使用前向散射对活体生物样本(即，细菌)进行尺寸测量。然而，很少有研究通过前向散射(fsc)定量分析亚微米颗粒尺寸测量的最小分辨率。此外，构建一个基于激光的微流控系统是昂贵且复杂的。该系统还需要对光束聚焦点和光强度水平进行校准和维护，这降低了系统的鲁棒性和便携性。

4、为了克服这些缺点，一种替代方法是使用基于阻抗的微流控流式细胞术(imc)。其为微粒尺寸测量、计数和细胞介电性能研究提供了无标记、高通量和低成本的特点。典型的imc芯片由填充有导电介质的微通道和连接至ac电压源的一对电极组成。为了抑制来自导电介质的电气噪声，在以往的研究中使用具有共面且平行的电极的差分配置来区分细胞表型和对微粒进行尺寸测量。几项研究表明，通过频率低于1mhz的施加ac电压而在电极之间产生的电流信号提供了通过微通道的微粒的尺寸信息。然而，当频率处于亚mhz时，双电层(edl)效应主导电流信号的测量，这可能会将噪声引入电气信号，导致信噪比(snr)下降。除了施加在电极上的ac电压之外，对edl效应有贡献的另一个因素是电极的阻抗感测面积，其与在相同的施加电压下edl效应的主导地位水平呈负相关。以往的研究已经报道了通过增加电极的感测面积来优化电极配置。但是这种配置需要纳米尺度对准，这给装置制造带来了困难。减小具有固定长度的电极的宽度和通道尺寸通常是提高微粒检测灵敏度的选择。然而，电极面积的减小会导致不利的edl效应的放大。在微流控细胞术中，通过电极的受限的阻抗感测面积来补偿在亚mhz下由edl效应引起的snr下降的解决方案尚未被讨论。

技术实现思路

1、因此，需要开发以亚微米精度表征微米尺度和亚微米尺度颗粒的替代方法。

2、在本发明的一个方面中，提供了一种基于阻抗的微流控流式细胞仪装置，包括：通道，其包括感测区域以感测流经通道的颗粒；和电极排列，其布置为与感测区域相邻，其中电极排列构造为在感测区域内产生差分电流的至少一个第一区域和差分电流的至少一个第二区域，并且其中所述至少一个第一区域和所述至少一个第二区域具有相反的电流相位。

3、如本文所使用的，术语“阻抗”或“电阻抗”指的是对交流电流动的阻力的量度。阻抗可以通过施加已知电压并测量电流来测量，或者通过施加已知电流并测量所得电压来测量。

4、术语“微流控”指的是小尺度(通常为亚毫米)颗粒，换言之，微毫米或更小尺度的颗粒的行为、控制和操纵。如本文所使用的，术语“基于阻抗的微流控流式细胞术”意味着包括测量在微流控通道中流动的单个颗粒的电气性能(具体为阻抗性能)的技术。基于阻抗的微流控流式细胞仪装置可以包括多个电极，所述多个电极布置为与通道相邻以在通道的感测区域内产生电场。

5、通道可以填充有介质或流体悬浮液。在一个实施方案中，介质是具有约1.6s/m的电导率的磷酸盐缓冲盐水(pbs)。

6、如本文所使用的，术语“感测区域”可以指的是通道内的区域，在该区域中，与感测区域相邻的电极可以产生一个或多个差分电流，所述电极与感测区域电气连通。

7、如本文所使用的，术语“颗粒”应当广义地解释为包括生物颗粒和合成颗粒。生物颗粒的示例包括动物细胞、植物细胞、细菌细胞、病毒、真菌以及诸如凋亡小体、白细胞、染色体、脂质体、核酸和蛋白质等其他生物颗粒。术语“颗粒”也可以包括诸如珠子、聚合物材料和金属等合成颗粒。

8、如本文所使用的，术语“相位”指的是正弦电压波形之间的角度或电压和电流之间的角度。术语“相位差”和“相位角”可互换使用。在电流或电压的上下文中，术语“相反相位”指的是180°或-180°的电压和电流之间的相位差。

9、在一个实施方案中，如本文所述的装置中的电极排列包括：中央电极；两个接地电极，其在中央电极的相反两侧布置为与中央电极相邻；以及两个端电极，其在与中央电极相反的所述两侧布置为与接地电极相邻，其中在各接地电极和相邻的端电极之间产生所述至少一个第一区域中的第一区域，并且其中在中央电极和相邻的各接地电极之间产生所述至少一个第二区域中的第二区域。

10、例如，电极排列可以包括呈共面排列的5个电极，其中这些电极以中央电极为中心对称地排列。在一个实施方案中，5电极排列包括在中间的中央电极，接着是位于中央电极两侧的2个接地电极，并且接着是位于电极排列的开始和结束处的2个端电极。

11、在各种实施方案中，术语“端电极”和“侧电极”可互换使用。

12、在另一个实施方案中，电极排列还包括布置在接地电极和端电极之间的浮动电极。

13、如本文所使用的，术语“浮动电极”意味着包括不直接连接至任何电压源的电极。浮动电极可以与其他电极附近的流体接触。浮动电极的存在改变了浮动电极附近的电场分布。浮动电极的存在对测量颗粒的通道内高度可能是有用的。

14、在另一个实施方案中，电极排列还包括两个浮动电极，其中各浮动电极布置在接地电极和端电极之间。

15、例如，电极排列可以包括呈共面排列的7个电极，其中这些电极以中央电极为中心对称地排列。在一个实施方案中，7电极排列包括在中间的中央电极，接着是位于中央电极两侧的2个接地电极，接着是位于接地电极的外侧的2个浮动电极，并且接着是位于电极排列的开始和结束处的2个端电极。7电极排列和5电极排列之间的区别在于，7电极排列包括一对浮动电极，各浮动电极位于接地电极和端电极之间。

16、在各种实施方案中，电极排列可以是对称的或非对称的。例如，如本文所述的5电极排列和7电极排列是对称的。

17、在一个实施方案中，中央电极连接至具有0°相位角的ac电压源，并且两个端电极连接至具有180°相位角的ac电压源。

18、在另一个实施方案中，如本文所述的电极排列包括另外的或附加的中央电极。具体地，可以存在多于一个的中央电极。中央电极可以彼此并排布置并且可以布置在两个接地电极之间。

19、在各种实施方案中，通道形成在由聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、环烯烃共聚物(coc)或环烯烃聚合物(cop)制成的基板中。

20、在一个实施方案中，电极排列布置在玻璃基板上，并且玻璃基板与通道的基板相邻。

21、在一个实施方案中，通道在感测区域中的截面尺寸的宽度约为3-50μm，并且高度约为3-50μm。

22、在一个实施方案中，电极是cr/au电极(10-30nm/70-200nm)。10-30nm指的是铬(cr)的厚度，并且70-200nm指的是金(au)的厚度。

23、在一个实施方案中，电极间隔开约1-20μm。在另一个实施方案中，电极间隔开约5μm。

24、在一个实施方案中，电极的宽度约为2-30μm。在另一个实施方案中，电极的宽度约为8-10μm。

25、在本发明的另一个方面中，提供了一种流体悬浮液中颗粒的特性的测定方法，所述方法包括：

26、(a)提供

27、i)用于接收流体悬浮液并允许流体悬浮液流经的通道，所述通道具有感测区域；和

28、ii)布置为与感测区域相邻的电极排列；

29、(b)向电极排列中的一个或多个电极施加电压，以在感测区域内产生差分电流的至少一个第一区域和差分电流的至少一个第二区域，并且其中所述至少一个第一区域和所述至少一个第二区域具有相反的电流相位；

30、(c)当颗粒流经感测区域时，获得由电极排列产生的差分电气信号；和

31、(d)基于差分电气信号来测定颗粒的特性。

32、如本文所使用的，术语“差分电气信号”意味着包括由两个接地电极之间的差分形成的电气信号。术语“差分电气信号”和“差分电流信号”可互换使用。当颗粒流经通道的感测区域时，产生差分电气信号。可以对差分电气信号进行适当的处理以测定颗粒的阻抗性能。决定颗粒的阻抗性能的因素包括颗粒的尺寸、结构、形状、组分和不透明度。

33、在一个实施方案中，如本文所述的方法中的电极排列包括：中央电极；两个接地电极，其在中央电极的相反两侧布置为与中央电极相邻；和两个端电极，其在与中央电极相反的所述两侧布置为与接地电极相邻，其中在各接地电极和相邻的端电极之间产生所述至少一个第一区域中的第一区域，并且其中在中央电极和相邻的各接地电极之间产生所述至少一个第二区域中的第二区域。

34、在另一个实施方案中，电极排列还包括布置在接地电极和端电极之间的浮动电极。

35、在另一个实施方案中，电极排列还包括两个浮动电极，其中所述两个浮动电极中的各者布置在接地电极和端电极之间。

36、在一个实施方案中，如本文所述的方法的步骤(b)包括向中央电极施加具有0°相位角的ac电压，和向两个端电极施加具有180°相位角的ac电压。

37、在另一个实施方案中，如本文所述的电极排列包括另外的或附加的中央电极。具体地，可以存在多于一个的中央电极。中央电极可以彼此并排布置并且可以布置在两个接地电极之间。

38、在一个实施方案中，在如本文所述的方法的步骤(c)中，由两个接地电极接收差分电气信号。

39、在一个实施方案中，在如本文所述的方法的步骤(c)之后，利用差分放大器对差分电气信号进行进一步差分。可以将差分电气信号的这种进一步差分称为次级有源差分级。

40、在一个实施方案中，在如本文所述的方法中，测定颗粒的特性的步骤包括测定颗粒的尺寸，其中所述方法还包括校准颗粒的尺寸的步骤。在端电极和接地电极之间产生的差分电流的第一区域可以提供关于颗粒位置的信息。在接地电极和中央电极之间产生的差分电流的第二区域可以提供关于颗粒的电气尺寸(electrical size)的信息。

41、在一个实施方案中，在如本文所述的方法中，测定颗粒的特性的步骤包括测定颗粒的数量。测定颗粒的数量可以包括对基于颗粒的阻抗性能表征的颗粒进行计数。决定颗粒的阻抗性能的因素包括颗粒的尺寸、结构、形状、组分和不透明度。颗粒的特性可以包括颗粒的尺寸、结构、形状、组分、不透明度以及其他光学或机械性能。

42、在一个实施方案中，在如本文所述的方法中，测定颗粒的特性的步骤包括识别颗粒。识别颗粒包括基于根据颗粒的阻抗性能测定的颗粒的特性对不同类型的颗粒进行分类。决定颗粒的阻抗性能的因素包括颗粒的尺寸、结构、形状、组分和不透明度。颗粒的特性可以包括颗粒的尺寸、结构、形状、组分、不透明度以及其他光学或机械性能。

43、在各种实施方案中，颗粒是生物颗粒。在一个实施方案中，生物颗粒是细胞。在一个实施方案中，生物颗粒是细菌细胞。在一个实施方案中，生物颗粒是白细胞。在一个实施方案中，生物颗粒是凋亡小体。

44、在一个实施方案中，本发明涉及一种无标记高通量基于阻抗的微流控装置，其具有新颖的7电极共面配置且用于以亚微米精度对微米尺度和亚微米尺度颗粒进行尺寸分析。所提出的电极排列被称为具有用于噪声消除的两级电气信号差分的双差分配置。与典型的三电极和浮动电极配置相比，新的双差分电极配置(即，7电极共面配置)实现了低至0.4μm精度的颗粒尺寸测量的最高灵敏度。尺寸校准方法可以用于校正微粒的尺寸信息，并且有助于利用本公开的imc系统实现低至200nm的最小尺寸分辨率。另外，本发明通过补偿edl效应证明了在亚mhz下的噪声抑制，并且能够在保持高snr的同时，选择宽范围的频率用于精确的电气表型。本发明的基于阻抗的双差分微流控细胞术dd-imc系统提供了混合物样本中各种尺寸的珠子的定量，这些珠子的各种尺寸与来自制造商数据表的尺寸信息一致。与商业化的基于荧光的细胞术相比，已经证明了凋亡小体的尺寸测量和定量显示出一致的浓度测量和更精确的尺寸分辨率。总之，所开发的dd-imc系统能够用于分析尺寸分布，表征电气表型，或与用于亚微米微粒和生物样本研究的下游分选集成。

45、在本说明书中对明显是以往公开的文件的列出或讨论不一定应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。

46、本文提及的任何文件均通过引用将其全部内容并入本文。