基于偏振各向异性测量的用于检测和测量目标物质的方法以及用于该方法的颗粒与流程

本发明涉及检测和测量待测样品中的目标物质的方法，并涉及用于该方法的颗粒。

背景技术：

1、在医疗和临床检查领域，需要对来自例如血液或采集的器官部分的痕量生物成分的高灵敏度检测以探究疾病的起因。在用于生物成分的检测技术中，广泛使用免疫测定法。作为免疫测定法之一，已知采用抗原-抗体反应的胶乳凝集法。“胶乳凝集法”是如下的方法：其旨在检测液体样品例如生物样品中的抗原，并且其包括将其上承载有例如特异性结合抗原的抗体的胶乳与液体样品混合，并测量胶乳凝集的程度，由此检测或量化所述抗原。

2、在胶乳凝集法中，抗原被与胶乳结合的抗体捕获，并且多个胶乳颗粒经由捕获的抗原交联，结果是发生凝集。即，可通过评价胶乳的凝集程度来量化液体样品例如生物样品中的抗原的量。可通过评价透射穿过液体样品或被液体样品散射的光量的变化来量化凝集程度。

3、胶乳凝集法可以以简单且快速的方式定量评价抗原，但是涉及问题，因为当液体样品例如生物样品中的抗原量低时不能检测到抗原。

4、为了改进检测灵敏度，可想到用包括以较高灵敏度检测发光特性的方法代替用于散射透射光的系统。特别地，已提出了例如利用荧光消偏振法的试样检查方法(专利文献1至3)。

5、在专利文献1中，提出了改进用于荧光消偏振法的装置以便临床使用。荧光消偏振法不需要测量物质和未反应的发光物质之间的初步分离，即被称作束缚/自由(b/f)分离的冲洗步骤，这在通常的荧光测量方法中是需要的。因此，可如同在胶乳凝集法中那样进行简单的试样检查。

6、此外，认为可通过与在胶乳凝集法中相同的测试系统来进行测量，在测量过程中仅混合与测量物质特异性反应的发光物质。然而，在专利文献1中提出了使用单分子例如荧光素作为发光材料，其原则上仅可应用于药物、低分子量抗原等。

7、在专利文献2中，为了能够检测高分子量物质例如蛋白质(在专利文献1中这是困难的)，提出了使用通过将具有长发光寿命的染料吸附到胶乳颗粒上获得的材料。在专利文献2中，提出了基于荧光消偏振法的原理通过平衡由于粒径增加所致液体中物质的旋转布朗运动的减少和发光寿命的长度来进行高分子量物质的测量。然而，出于抑制非特异性吸附的目的，作为生物分子的牛血清白蛋白(bsa)承载在颗粒的表面上，并由此可以由于展宽的颗粒尺寸分布和bsa(其为蛋白质)而发生批与批的差异。因此，很难说实现了极高灵敏度的抗原检测。

8、在专利文献3中，提出了通过抗原-抗体反应使荧光标记和目标抗原竞争性地吸附到大颗粒上从而进行测量的方法。然而，在该方法中，一个抗体与一个荧光标记反应，因此难以以高灵敏度掌握偏振程度的变化。

9、[引用文献列表]

10、[专利文献]

11、专利文献1:日本专利公开号h03-52575

12、专利文献2:日本专利号2893772

13、专利文献3:日本专利申请公开号h03-103765

技术实现思路

0、发明概述

1、[技术问题]

2、鉴于这样的背景技术做出了本发明，并且本发明的目标是基于偏振各向异性的变化提供一种高灵敏度测量方法和检查试剂盒。具体地，提供了通过提高偏振各向异性的变化更灵敏地掌握反应的技术。

3、[问题的解决方案]

4、本发明提供一种确定样品液体中的目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：

5、(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒，和平均粒径大于第一颗粒并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；

6、(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和

7、(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者。

8、本发明还提供包括第一颗粒和第二颗粒的检查试剂盒及其制造方法。

9、[发明的有益效果]

10、根据本发明，可通过使用偏振光测量以高灵敏度检测液体中颗粒的凝集，并因此能够以高灵敏度测量目标物质。特别地，能够从颗粒在液体中凝集时检测到的偏振各向异性的变化更灵敏地掌握反应。

11、另外，提供了通过在颗粒的表面上形成亲水层在不使用bsa等的情况下各自对非特异吸附具有高抑制作用的颗粒。因此，本发明的颗粒更有利地用于基于偏振各向异性的测量，能够以甚至更高的灵敏度测量。

技术特征：

1.一种确定样品液体中的目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下方程1确定偏振各向异性：

3.一种检查试剂盒，其用于确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者，该检查试剂盒包含：

4.根据权利要求3所述的检查试剂盒，

5.根据权利要求3或4所述的检查试剂盒，其中所述稀土络合物是选自由以下构成的组中的稀土的络合物：铕、铽、钕、铒、钇、镧、铈、钐、钆、镝、铥、镱和钪。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的检查试剂盒，

7.根据权利要求6所述的检查试剂盒，其中凝集体在分散介质中显示0.1以上的偏振各向异性。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的检查试剂盒，

9.根据权利要求3至8中任一项所述的检查试剂盒，其中第二颗粒不被波长为300nm以上且450nm以下的激发光激发。

10.根据权利要求3至9中任一项所述的检查试剂盒，其中第二颗粒没有在550nm以上至650nm以下的波长区域中的发光最大值。

11.根据权利要求3至10中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒的平均粒径为20nm以上且400nm以下。

12.根据权利要求3至11中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒各自具有与目标物质特异性结合的配体。

13.根据权利要求12所述的检查试剂盒，其中所述配体选自由以下构成的组：抗体、抗原和核酸。

14.根据权利要求3至13中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒中的至少任一种在它们的颗粒表面上具有含亲水聚合物的层，所述亲水聚合物含有醚、甜菜碱和吡咯烷酮环中任一种。

15.根据权利要求3至14中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中。

16.根据权利要求3至15中任一项所述的检查试剂盒，其中检查试剂盒被包封在壳体中。

17.权利要求3至16中任一项所述的检查试剂盒的第一颗粒的制造方法，该方法包括至少：

18.权利要求3至16中任一项所述的检查试剂盒的制造方法，该方法包括将第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中的步骤。

技术总结
本发明解决了提供以高检测灵敏度测量目标物质的方法和试剂盒的问题。提供了测量样品液体中目标物质存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒和具有比第一颗粒更大的平均粒径并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性来确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者。

技术研发人员：挂川法重,增村考洋,榊原悌互,中岛生朗,山内文生,金崎健吾
受保护的技术使用者：佳能株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17