样本载体、其用途和方法，特别用于检测病原体与流程

本发明涉及根据主权利要求前序部分的样本载体、其用途以及用于从样本捕获检测辐射的方法。

背景技术：

1、在显微方法的许多应用中，成像的目的不是能够详细了解对象的结构，而是确定例如某种类型的细胞、细胞器和/或通常为生物的其他对象是否存在。为此，在这种情况下使用光学显微镜是可取的，首先是因为操作更简单，其次是因为与高分辨率显微镜相比更低的设备成本。

2、然而，如果要检测非常小的对象，使用传统光学显微镜的一个障碍是这些对象可能较小或者比光学显微镜的分辨率极限更小。例如，病毒的尺寸通常在15至440nm之间。因此，引起病毒性疾病covid 19(冠状病毒疾病19)的病原体，即sars-cov-2病毒的尺寸在60至160nm之间。其他病原体，如衣原体和支原体的尺寸在150nm至约800nm之间。

3、特别地，生物对象可以具有特定的标记，例如蛋白质或探针(以下也称为标记)，其发射检测辐射。这些特定的标记能够使对象可视化，即使该对象不是光学分辨的，而只是被描绘为荧光点。原则上，可以以这种方式检测对象的存在，并且可以任选地确定其浓度(滴定度)。

4、然而，当光学地捕获已标记的微观对象时，来自样本背景的不需要的信号可能会成为一个重大问题。例如，如果待检测的对象具有荧光标记，则所谓的样本背景荧光可能导致光学捕获的信息片段的显著篡改。这种背景荧光可以由未结合的标记产生，并由样本中的其他对象(例如细胞或细胞碎片)触发。由于病毒等小对象发出的荧光信号强度很低，背景荧光通常很成问题。

5、现有技术已经公开了用于减少不需要的背景信号的技术选择。因此，tirf(全内反射荧光)显微镜可以用作检测方法。由于在小空间中产生的瞬逝场，只有例如透射照明的样本载体的表面附近的标记对象被激发，并且只有由此发射的荧光辐射被检测为检测辐射，而样本的背景没有被激发(例如参见de 10 2005 023 768 b4)。

6、在替代方案中，可以使用共焦显微方法来减少背景荧光；然而，与tirf显微镜相比，在这种情况下对背景荧光的抑制效果稍弱。

7、来自tirf显微镜和共焦显微镜的方法都是复杂且昂贵的方法。此外，这些方法对外部影响敏感，并且需要复杂的校准，在许多情况下需要定期重复校准。由于其复杂性，这些方法不容易操作，因此仅在有限的程度上适于常规使用，例如在具有高样本通量的实验室中(例如，筛选)。因此，在tirf显微镜或共焦显微镜的基础上生产用于大规模诊断比如病毒的小对象的设备实际上是不容易实现的。

8、更容易实施的显微镜方法，尤其是宽视场中样本的照射和检测，通常需要特定的基底和样本载体，其设计能够选择性地检测仅来自样本特定层的信号。来自xfold imaging(https://xfoldimaging.com；2021年6月18日)的一种此类解决方案仅针对一个波长或几个波长进行了优化，其效果明显弱于tirf显微镜方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提出另一种可能性，即允许以显著降低的背景噪声、尤其是降低的背景荧光来检测甚至非常小的对象。同时，本发明应该可用于高样本通量。

2、该目的是通过独立权利要求的主题实现的。从属权利要求涉及有利的发展。

3、实现该目的的一种方式是通过样本载体，该样本载体至少包括由壁围设并用于接收样本的样本空间，以及用于以样本填充样本空间的入口。在这种情况下，该壁具有至少一个区域，该区域对于源自样本的检测辐射是透明的并且用作检测窗口。

4、根据本发明的样本载体的特征在于，在垂直于壁的透明区域的至少一个方向上，样本空间在壁的相对内侧(以下也称为侧壁)之间具有不超过50μm的净距，特别是不超过25μm，有利地不超过5μm，并且特别是不超过1μm。

5、在根据本发明的样本载体的进一步有利的实施例中，净距不超过0.8μm，特别是不超过0.6μm，有利地不超过0.4μm，特别有利地不超过0.2μm。

6、激发辐射的效果是产生检测辐射，该激发辐射尤其用于辐射到样本空间中，其中可能通过进一步的技术措施来减少或甚至避免不需要的反射。有利的是，使用景深等于或大于净距的物镜来捕获检测辐射，因此有利的是，可省去在样本空间内的区域上的聚焦，特别是在净距内的。

7、在辐射有或者即将辐射有激发辐射的侧面或激发窗口(见下文)上，样本载体可以为此目的具有与激发辐射的波长范围适当匹配的滤光器，该滤光器例如是样本载体侧面的涂层、由滤光器形成的层或设有滤光器的基板的形式。

8、本发明的一个重要概念包括在至少一个方向上限制样本空间，使得除了被标记的对象之外，只有很少空间或者没有更多空间容纳样本的其他成分，不需要的光学信号、尤其是非特异性荧光辐射是从这些成分辐射的。如果待检测的对象与样本的其他成分相比较小，则可以有利地使用根据本发明的样本载体。

9、例如，样本特别包括液体介质，待检测的对象位于该液体介质中。例如，这种样本特别地可以是含有病毒和/或微生物的悬浮液或凝胶。

10、在本说明书的含义中，术语“对象”主要被理解为生物对象，如病毒和微生物或病毒颗粒，如碎片和包膜。本发明还能够检测朊病毒(例如10至15nm)、细胞成分、细胞器、凝聚体(蛋白质、分子，例如生物的和/或与无机成分结合的蛋白质)，以及尺寸小于样本空间的净距的无机对象。本发明可有利地用于检测病原体，即引起疾病的对象。

11、用作检测窗口的样本空间的壁区域可以占据整个壁或大部分壁。在进一步的实施例中，检测窗口可以至少一个条形包围样本空间或者形成壁的一部分。这些实施例选项例如允许从不同方向捕获检测辐射和/或允许样本载体相对于检测方向旋转和/或枢转。如果激发辐射和/或检测辐射在枢转过程的范围内倾斜地穿过该壁，那么由此引起的像差可以通过光学校正元件和/或通过图像处理范围内的计算来校正。由于在本发明的范围内检测荧光对象时，所采集的图像数据的高空间分辨率不是绝对必要的，因此可以有利地省去复杂的校正措施。

12、检测辐射的原因可在待捕获的对象中找到，这些对象本身光学地发射检测辐射或者被激发出这种发射。为了实现检测辐射的高特异性，可以为对象提供标记，尤其是荧光标记(荧光团)，可以选择性地激发该标记以发射特定的检测辐射。特别地，激发辐射可以用于激发目的。这使得激发辐射必须能够耦合(特别是辐射)到样本空间中，并且使得检测辐射能够穿过检测窗口。为此，样本载体具有激发窗口。

13、在样本载体的可能的实施例选项中，激发辐射可以通过检测窗口辐射到样本空间中。在进一步的实施例中，可以存在单独的激发窗口。在这两种情况下，检测窗口或激发窗口的材料必须对激发辐射的波长或波长范围是透射的。

14、可选地，也可以通过入口或可选地存在的出口耦合激发辐射，其中在这种情况下该入口或出口可以被认为是激发窗口。

15、在样本载体的实际使用过程中，当样本空间被填充时，必须移除(例如移动)先前存在于其中的介质，例如空气、样本介质、冲洗介质等，和/或先前存在于其中的样本。为此，样本载体可以具有出口，当样本空间被填充时，先前存在于样本空间中的介质可以通过该出口从样本空间中逸出。

16、在入口具有适当尺寸的情况下，如果经由入口的另一部分供应另一介质，则样本空间中存在的介质也可以经由入口的一部分排出。特别地，这在样本空间以通道(见下文)的形式实施时是可行的，该通道在一个方向上具有不超过50μm的净距，但在另一个方向上尺寸较大。

17、样本空间的壁可以由不同的元件构成。例如，可以存在由玻璃和/或塑料制成的侧壁，其中至少一个侧壁可以是薄膜形式，而至少另一个侧壁具有比薄膜更大的壁厚。

18、这种实施例有利地在由薄膜制成的侧壁区域中结合了对激发辐射和/或检测辐射的高光学透射率，同时至少另一个侧壁支持样本载体抵抗扭转和/或弯曲的稳定性。

19、玻璃和/或塑料可以用作检测窗口和/或激发窗口的材料。塑料可以具有非常薄的实施例(薄膜)，例如材料强度小于1mm。

20、可以在相对的侧壁之间插入间隔件，或者可以在至少一个侧壁上施加或形成凸起边缘，以便在侧壁之间产生净距并保持其恒定。例如，可以漆的形式或通过基于阴极溅射的溅射沉积来施加该凸起边缘。在其他实施例中，该凸起边缘可以在样本载体的生产过程中共同铸造，或者随后铸造或粘合。该边缘也可以通过机械加工形成。原则上，样本空间也可以通过从一块固体材料上去除材料来形成。举例来说，为此可以使用诸如激光烧蚀、双光子方法、蚀刻方法和/或机械方法之类的方法。

21、在进一步的实施例中，样本载体可以以载体中存在的通道的形式实施，例如载体板中的通道。该通道可以被侧壁覆盖，以便产生本发明意义内的样本空间。具有这种通道和适合作为盖子的侧壁的载体可以作为半成品提供，用于生产根据本发明的样本载体。

22、在载体板中通道形式的样本载体的可能实施例中，从通道底部到支撑表面的净距不超过0.2μm至50μm，侧壁可以作为样本空间的壁的一部分施加到该支撑表面上

23、在样本载体的进一步的实施例中，通道可以是载体板中的槽的形式。至少在检测窗口区域内，槽的净距不超过0.2μm至50μm。如果起作用的毛细作用力大到足以将样本保持在槽形通道内，则可以省去通道纵向开口的盖子。为此，沿着槽形通道的纵向开口的通道壁可以具有涂层，该涂层不允许被样本润湿或者难以被润湿。例如，根据样本的性质，该涂层可以是疏水的或疏油的。

24、如果通道从载体板的一个端侧完全贯穿到另一个端侧，那么在一个端侧的通道开口可以用作入口。另一个通道开口可以可选地用作出口。

25、在槽形通道的延伸方向上进行检测。激发辐射可以通过检测窗口入射，但是可选地也可以通过通道的未被覆盖的纵向开口或通过入口或出口入射。

26、在进一步的实施例中，根据本发明的样本载体的横截面，尤其是其壁，至少在检测窗口的范围内并且与该横截面正交，可以在至少一侧变平，可为半圆形、圆形、三角形、四边形、多边形，例如五边形、六边形、七边形或八边形或梯形。

27、虽然圆形或半圆形横截面允许从样本载体的不同侧进行激发和/或检测，但是具有多边形横截面的实施例增加了样本载体抵抗由扭转和/或弯曲引起的载荷的稳定性。具有多边形横截面的样本载体的一些或所有侧面可以实施为检测窗口。除了制造成本低之外，管形式的样本载体的实施例还能够实现各种用途。

28、在进一步的实施例中，样本载体的横截面由不同的形状构成。这种例子包括半圆形和扁平形或上述圆角和多边形的组合。

29、样本载体的外部形状的横截面也可能不同于样本空间的壁形状的横截面。例如，样本空间的壁可以具有圆形横截面，而外部形状例如具有多边形设计。

30、还可能的是，样本空间和/或外部形状的横截面沿着样本载体的范围变化，例如将具有圆形横截面的检测窗口的多功能性与多边形外部形状的增加的稳定性相结合。

31、如果沿着壁的外侧存在至少一个稳定元件，也可以获得根据本发明的样本载体的改进的稳定性，其中壁被加强以抵抗由于其效果而导致的变形。这种外部加强件可以由附接元件形成，例如由塑料、金属或复合材料制成的粘接或焊接元件。还可能的是，样本载体具有至少一个以加强方式形成的拐角区域或壁材料的至少一个纵向隆起。

32、如上所述，本发明的概念基本上基于仅允许那些实际上应该检测其是否存在的对象进入样本空间的情况。在根据本发明的样本载体的设计的发展中，过滤元件可以布置在入口处，过滤元件的网孔尺寸有利地不超过净距的80％，并且其效果是防止较大的对象进入样本空间。在如此实施的样本载体的另一个实施例中，网孔尺寸不超过相应净距的50％或不超过25％。

33、在进一步的实施例中，用于限制到达样本空间的对象的尺寸的技术措施可以通过使入口的孔径宽度小于样本空间的净距来实现。以这种方式，入口由于其孔径宽度而起到过滤作用。当填充样本空间和/或当样本或冲洗介质流过样本空间时，样本空间具有比孔径宽度更大的净宽度的情况有利地避免了高流动阻力，或者限制了入口区域的高流动阻力。

34、对于用于避免样本或样本介质从上述样本空间中出现的涂层，替代地或附加地，面向样本空间的壁内侧(有利地是检测窗口的内侧)的至少一个区域可以设有用于结合、特别是特异性地结合样本成分的涂层。这种涂层可以有利地增加样本中存在的对象(例如待检测的病毒或其他病原体)出现在检测窗口区域中或在那里聚集的可能性。

35、为了特异性地结合待检测的对象，特别是病毒，该涂层可以包含聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸和/或胶原蛋白。在进一步的实施例中，在每种情况下，壁内侧的区域可以设置有不同的涂层，以减少待结合对象的不需要的位移效应。此外或替代地，涂层可以包含针对特定对象并选择性结合该对象的抗体。

36、提供根据本发明的样本载体，特别用于捕获样本中激发的荧光辐射作为检测辐射并可选地对其进行评估或打算此后进行评估。简而言之，荧光辐射是由能量充足的激发辐射引起的，该激发辐射由于共振现象导致至少一个光子的吸收，特别是激发辐射的光子与原子或电子跃迁的共振，以及导致至少一个光子发射的检测辐射。因此，这种检测辐射的产生与例如激发辐射被散射并且不发生共振现象或共振现象与检测辐射的发射不相关的过程完全不同。

37、本发明可以有利地用于检测作为待检测对象的、样本中存在的病毒或病毒颗粒。此外，本发明可以用于检测相应的小微生物，例如衣原体、支原体或其他细菌(如果它们的尺寸小于净距的话)，并且这些微生物可以被引入样本空间中并且可选地可以被输送通过样本空间。例如，衣原体和支原体的尺寸在150nm和大约800nm之间，而许多细菌的尺寸在1μm和5μm之间。有利的是，根据待检测对象的尺寸选择样本空间的净距。为此，可以将特定的标记结合到对象上，所述标记发射检测辐射或者能够被激发发射检测辐射。根据本发明的样本载体可有利地用于检测病原体，如病毒，并可选地用于确定或估计单个样本或多个样本的相关病原体的滴度。在后一种使用情况下，最好在样本处理后用冲洗介质清洗样本载体。成本有效和标准化生产的选择使得根据本发明的样本载体能够用于整组人群或人口统计组的大规模测试(筛查)。

38、入射激发辐射和/或捕获检测辐射可以在反射光装置或透射光装置中实现。在进一步的实施例中，激发辐射可以以光片的形式入射。

39、为了在捕获检测辐射期间获得高记录质量和/或灵敏度，用于捕获检测辐射的物镜可以实施为浸没物镜。在这种情况下，浸没油、水或含水混合物可以用作浸没介质。在这种情况下，所使用的浸没应该有助于使激发辐射过渡到样本空间中，从而例如有利地避免激发辐射的不需要的反射，尤其是全内反射。在本发明的范围内，浸没介质的使用有利地用于避免在样本空间内聚焦。

40、也可以使用固体浸没(例如参见us2015/0241682 a1)或浸没基体(de 102017 217192a1)。通过其非常简单的操作以及较低的设备和工艺工程复杂性，这些有助于在诸如筛查的应用中使用根据本发明的样本载体。

41、因此，根据本发明的样本载体可以用于从样本捕获检测辐射的方法中。为此，提供了根据本发明的样本载体。样本通过入口被引入样本空间。如果样本空间优选没有气泡，并且如果可能预先存在于样本空间中的冲洗介质或用于保持壁内侧区域的可选涂层的活性的缓冲介质已经被包含待检测对象的样本或样本介质完全替代，则使用检测光学单元和检测器通过检测窗口捕获来自样本的检测辐射，并且随后评估所述检测辐射。由于样本空间小并且在净距方向上被清晰地界定，可选地不需要在净距方向上聚焦检测光学单元。在这种情况下，所使用的检测物镜的景深应该超过待检测对象的尺寸，例如病毒在净距方向上的尺寸。

42、在这种情形下，在最简单的情况下，pmt可以用作检测器。为了除了检测对于检测目的而言足够强的检测辐射是否存在之外、还能够获得例如关于发射检测辐射的对象的空间分布、数量和强度(数量)的信息，例如可以使用比如pmt阵列或spad阵列或比如ccd、cmos或scmos的二维检测器的检测器装置作为检测器。此外或替代地，捕获的检测辐射的测量值可以显示在显示器上并由用户视觉检测。

43、如上面已经进一步解释的，位于样本空间中的样本可以通过激发辐射来照射，其中至少一种检测辐射的发射由激发辐射的效应激发。在这种情况下，当样本在样本载体中静止存在时，可以捕获检测辐射。在该方法的进一步设计中，如果样本载体打算用于多个样本，则可以将样本连续或顺序地输送通过样本空间。在连续输送的情况下，可以以时间间隔或连续地捕获检测辐射。如果样本被顺序地输送，也就是说输送阶段和静止阶段交替进行，那么每当新样本出现在样本空间中时，检测步骤总是可以至少执行一次，并且输送被有利地中断。

44、因此，可以使用来自微流体领域的方法和技术元件来实现样本的引入、移动和/或洗出。例如，可用的泵、阀和/或混合器可以分别设计成微型泵、微型阀和微型混合器。此外或替代地，样本载体可以集成在所谓的(微流体)芯片中或可以连接到这样的芯片。举例来说，可以在这样的芯片上进行必要的标记和/或染色操作，例如在单独的通道和反应室中进行。这样制备的样本随后通过芯片的通道输送至根据本发明的样本载体。通过这样的实施例，可以有利地进一步提高使用根据本发明的样本载体的自动化程度。

45、例如，可以利用因尺寸小而在样本空间中起作用的毛细效应来产生样本的输送运动。在根据本发明的方法的进一步设计中，样本可以通过泵输送并压入或通过样本空间。相应的说明适用于负压的产生和样本的吸入。

46、如果一个样本或多个样本被输送通过样本空间，则存在借助于激发辐射的可选激发的重复，尤其是每当样本空间的电荷在连续输送期间被另一电荷替换时。

47、在第一次将样本引入样本空间之前，或者在引入一个样本和引入另一个样本之间，可以使用冲洗介质从样本空间中清除前一样本的残留物。

48、在用于病毒和/或微生物的检测方法的情况下，特别希望在可能的情况下不获得任何假阴性测量结果，也就是说期望可以非常可靠地检测例如病毒载量的实际存在。为此，如果在捕获检测辐射时和/或在检测辐射的两次捕获过程之间移动样本载体，尤其是旋转和/或倾斜样本载体，则可能是有帮助的，从而在每种情况下都捕获检测辐射或者可从壁的不同区域(检测窗口)捕获检测辐射。