用于对剪切应力对哺乳动物细胞系的影响进行定量的方法与流程

本发明总体上涉及对剪切应力对细胞的作用进行表征的系统和方法。

背景技术：

1、通过生物生产过程和细胞培养技术产生的流体动力学力可能会对细胞完整性、重组蛋白产生和细胞系的整体活力产生不利影响。因此，本领域需要对流体动力学力，例如剪切应力对细胞系的作用进行定量。

2、因此，本发明的目的是提供用于鉴定细胞对不同剪切应力速率的敏感性的方法。本发明进一步考虑利用对剪切应力进行定量的结果来为生物生产过程提供信息并进行改进。

技术实现思路

1、本发明提供了对剪切应力对细胞的影响进行定量的方法。在本文所公开的实施例中，本发明包括以下步骤：将固定化细胞暴露于引起剪切应力的力，并且对所述固定化细胞进行纳米压痕以确定所述固定化细胞在不同应力水平下的机械特性。

2、在本文所公开的若干实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、人胚胎肾293(hek293)细胞、hela细胞、per.c6细胞、非分泌型鼠类骨髓瘤(nso)细胞或sp2/0鼠类骨髓瘤细胞。在另外的实施例中，所述细胞是悬浮细胞。

3、在另外的实施例中，所述细胞是悬浮细胞。在又另一个实施例中，所述细胞是使用细胞和组织粘合剂(cta)固定的。在若干实施例中，所述细胞和组织粘合剂是cell-tak。在本文所公开的若干实施例中，所述细胞是cho细胞。

4、在本文所公开的若干实施例中，所述引起对细胞的剪切应力的力是通过摇瓶搅拌产生的。在另一个实施例中，引起对细胞的剪切应力的力是由流体泵系统产生的。在又另一个实施例中，引起对细胞的剪切应力的力是通过生物反应器搅拌产生的。

5、在本文所公开的若干实施例中，对所述细胞进行纳米压痕是通过纳米压痕仪进行的。在一些实施例中，所述纳米压痕仪包括光学探针。在若干实施例中，所述光学探针包括悬臂。在一个实施例中，所述探针从预先校准的距离向所述细胞的表面机械地降低。在相似实施例中，所述探针被机械地降低，持续约两秒时段。

6、在本文所公开的若干实施例中，所述细胞在与所述悬臂接触时对所述悬臂施加力，从而使所述悬臂弯曲。在相似实施例中，所述悬臂与所述细胞接触，持续约一秒至约五秒。

7、在本文所公开的一些实施例中，所述悬臂与所述细胞接触，持续约六秒。在相似实施例中，所述悬臂产生约1f hz、约2f hz、约4f hz和约10f hz的递增振荡频率。在另外的实施例中，在每个递增振荡频率之间约两秒的时段内不产生振荡频率。

8、在本文所公开的方法的又另一个实施例中，所述纳米压痕仪使所述细胞经受约六轮纳米压痕。在相似实施例中，每个后续纳米压痕被放置成距前一纳米压痕约2μm。

9、在本文所公开的若干实施例中，所述细胞的所述机械特性是在若干轮纳米压痕之后确定的。在一些实施例中，所述细胞的所述机械特性包括细胞刚度。在另外的实施例中，通过杨氏模量(ym)和有效杨氏模量(eym)来测量细胞刚度。在一些实施例中，细胞在约26小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym小于约50x pa。在其它实施例中，细胞在约46小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym小于约50x pa。在另一个实施例中，细胞在72小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym大于约500x pa。

10、在本文所公开的若干实施例中，通过计算储能模量(e’)来确定细胞刚度。在一些实施例中，通过计算损耗模量(e”)来确定细胞刚度。在某些实施例中，在搅拌至少约两天之后，在约1f、约2f和约10f hz的频率下，e’值高于e”值，表示所述细胞的弹性。在其它某些实施例中，在搅拌至少约两天之后，在约4f hz的频率下，e”值高于e’值，表示所述细胞的粘度。

11、本公开另外提供了产生贴壁细胞系的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)以约2d×105个细胞/ml至约6d×105个细胞/ml的接种密度在烧瓶中接种悬浮细胞；(b)向烧瓶中引入化学成分确定的培养基，所述培养基补充有浓度为约0.5y％的胎牛血清(fbs)至约4y％fbs；(c)使用生物分析仪测量悬浮细胞的活细胞密度(vcd)；(d)允许所述细胞生长至贴壁/悬浮细胞汇合率不超过85％的总汇合率；(e)使培养基传代以从烧瓶中去除悬浮细胞；(f)将烧瓶浸没在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中；(g)测量剩余贴壁细胞的vcd；以及(h)重复步骤b-g，持续至少72小时并且持续至多六次传代。

12、在本发明的一些方面，贴壁细胞的密度在六次传代之后为至少13.84d×105个细胞/ml。

13、本文所公开的本发明的其它方面描述了通过本文所公开的方法产生的细胞。

14、本公开另外提供了生物生产优化的方法，所述方法包括：对细胞施加剪切应力；对剪切应力对细胞的影响进行定量；以及使用剪切应力数据来调整在生物生产期间施加的剪切力的水平。

15、在一些实施例中，优化使得产物滴度和产率增加。在另一个实施例中，优化使得细胞活力增加。在又另一个实施例中，优化使得产物质量增加。在另外的实施例中，产物质量是通过糖基化效率确定的。

16、本公开进一步提供了开发对剪切应力具有抗性的细胞系的方法，所述方法包括：用增加水平的剪切力对所述细胞施加剪切应力；对剪切应力对细胞的影响进行定量；以及选择抗性细胞以进一步用于生物生产。

1.一种对剪切应力对细胞的影响进行定量的方法，其中所述方法包括以下步骤

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、人胚胎肾293(hek293)细胞、hela细胞、per.c6细胞、非分泌型鼠类骨髓瘤(nso)细胞或sp2/0鼠类骨髓瘤细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细胞是悬浮细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞是使用细胞和组织粘合剂固定的。

6.根据权利要求4至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是cho细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞和组织粘合剂是cell-tak。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述引起对细胞的剪切应力的力是通过摇瓶搅拌产生的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述引起对细胞的剪切应力的力是通过生物反应器搅拌产生的。

10.根据权利要求1所述的方法，其中对所述细胞进行纳米压痕是通过纳米压痕仪进行的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述纳米压痕仪包括光学探针。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述光学探针包括悬臂。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述探针从预先校准的距离向所述细胞的表面机械地降低。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述探针被降低，持续两秒时段。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中在与所述悬臂接触时，所述细胞对所述悬臂施加力，从而使所述悬臂弯曲。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针被机械地升高，持续两秒时段。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬臂与细胞表面接触，持续一秒。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬臂与细胞表面接触，持续五秒。

19.根据权利要求18所述的方法，其中在与所述细胞接触时，所述悬臂产生1f hz、2fhz、4f hz和10f hz的多个递增振荡频率。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在产生每个递增振荡频率之间的两秒时段内不产生振荡频率。

21.根据权利要求10至20中任一项所述的方法，其中所述纳米压痕仪使所述细胞经受六轮纳米压痕。

22.根据权利要求21所述的方法，其中每个后续纳米压痕被放置成距前一纳米压痕2μm。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞的所述机械特性是在纳米压痕之后确定的。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞的所述机械特性包括细胞刚度。

25.根据权利要求24所述的方法，其中通过计算杨氏模量(ym)和有效杨氏模量(eym)来确定细胞刚度。

26.根据权利要求25所述的方法，其中细胞在26小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym小于约50x pa。

27.根据权利要求25所述的方法，其中细胞在46小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym小于约50x pa。

28.根据权利要求25所述的方法，其中细胞在72小时的剪切应力之后的所述ym和所述eym大于约500x pa。

29.根据权利要求24所述的方法，其中通过计算储能模量(e’)来确定细胞刚度。

30.根据权利要求24所述的方法，其中通过计算损耗模量(e”)来确定细胞刚度。

31.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其中在搅拌至少两天之后，在1f、2f和10f hz的频率下，e’值高于e”值，表示所述细胞的弹性。

32.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其中在搅拌至少两天之后，在4fhz的频率下，e”值高于e’值，表示所述细胞的粘度。

33.一种生物生产优化方法，所述方法包括：

34.根据权利要求33所述的方法，其中优化使得产物滴度和产率增加。

35.根据权利要求33所述的方法，其中优化使得细胞活力增加。

36.根据权利要求33所述的方法，其中优化使得产物质量增加。

37.根据权利要求36所述的方法，其中产物质量是通过糖基化效率确定的。

38.一种开发对剪切应力具有抗性的细胞系的方法，所述方法包括