本发明涉及一种简便地评估血浆中pai-1及α2ap的残存抗纤维蛋白溶解活性的方法。本技术根据于2021年10月29日在日本技术的日本特愿2021-177098号主张优先权，并将其内容引用在本文中。
背景技术：
1、脑梗塞等血栓症治疗中有溶栓疗法。该治疗方法是一种利用组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator：tpa)等纤溶酶原激活剂(pas)，在血液中或血栓表面激活纤溶酶原，并由产生的纤溶酶溶解血栓的主要构成分子即纤维蛋白的治疗方法。为了改善症状和避免后遗症，需要进行迅速的血栓溶解。
2、治疗纤溶亢进导致的出血性病况有抗纤溶疗法。该治疗方法是一种利用氨甲环酸抑制纤溶酶原或纤溶酶与血栓表面的结合，并抑制纤溶酶原在纤维蛋白上的激活和纤溶酶的纤维蛋白分解的治疗方法。即，在抗纤溶疗法中，通过抑制过度的纤溶活性，来改善出血症状。
3、在血浆中，存在相对于pas及纤溶酶的生理抑制剂即纤溶酶原激活剂抑制剂-类型1(plasminogen activator inhibitor type 1(pai-1))和α2-抗纤溶酶(α2ap)，控制了过度的纤溶(纤维素溶解)活性的表达。血液的纤溶活性表达能力由血浆中的tpa量和pai-1量的平衡决定(参照非专利文献1和2)。为了迅速产生纤溶酶，需要施用超过pai-1量的pas，另外，为了有效地溶解血栓，需要产生一定程度消耗血浆中α2ap量的量的纤溶酶。另一方面，如果施用过度消耗血浆中α2ap量的pas，则不仅是纤维蛋白，血浆中的纤维蛋白原也会被纤溶酶分解，呈现全身性的不可控制的出血。因此，在溶栓疗法中，为了确定安全且有效的pas剂量，重要的是要频繁定量血浆中残存的pai-1量及α2ap量。另外，在头部外伤后等纤溶亢进状态下，为了决定可否使用氨甲环酸进行抗纤溶疗法，重要的是：通过定量血浆中残存的pai-1量及α2ap量来确认其消耗量，从而掌握纤溶亢进病况。当血浆中的pai-1及α2ap的消耗导致抗纤维蛋白溶解性减弱时，需要施用氨甲环酸。另一方面，当pai-1作为急性期蛋白增加且抗纤维蛋白溶解性增强时，由于伴随微血栓形成的脏器损害的危险性增加，因此，应该避免施用氨甲环酸。
4、目前，血浆中残存的pai-1及α2ap的活性量或抗原量的测定需要固有的测定试剂盒，且使用该测定试剂盒时，需要较长时间才能获得结果。作为一种可以在床旁操作的凝血/纤溶活性的测定方法，有一种以teg(thromboelastography)和rotem(rotationalthromboelastometry)等血凝块的粘度变化为指标的凝血/纤溶活性的测定方法，在这些测定方法中，无法测定血浆中的pai-1及α2ap的残存活性。
5、这样，在目前的针对急性脑梗塞等的溶栓疗法中，推荐不进行抗纤维蛋白溶解性的定量而遵循重视安全性的协议的pas的施用方法。但是，在败血症和伴随covid-19(2019年发生的新型冠状病毒感染症)的血栓症患者中，纤溶酶原、纤维蛋白原、pai-1、α2ap等纤溶因子的血药浓度本来就经常偏离正常值，在标准的协议中，可能无法获得充分的药效，或者相反，也有可能导致过量施用。虽然也尝试了covid-19的重症患者的tpa治疗，但设定剂量困难一直是一个问题。另外，引起纤溶亢进的出血性病况见于多发性外伤和头部外伤的超急性期、围产期等，但特别是在前一种情况下，由于在亚急性期过渡到纤溶阻断，因此，作为能否进行抗纤溶疗法及适应时间的判断，需要定量抗纤维蛋白溶解性，掌握其减弱程度。
6、另一方面，发明人进行了如下报告：pai-1有与pas形成共复合体的活性型、不与pas反应的活性潜在型、及容易被pas切断的基质型3种形态；如果活性型pai-1用0.1％或0.01％的十二烷基硫酸钠(sds)处理，则会结构变化为活性潜在型或基质型而失去其抑制活性；另外，如果用triton x-100进行处理，则即使在pai-1存在下也未影响其抑制活性，可以充分测定pas的活性(非专利文献3)。并且还报告了：α2ap也同样，在0.1％或0.01％的sds处理下失活，通过与triton x-100并用，即使在α2ap存在下也能够充分测定纤溶酶活性(非专利文献4)。
7、现有技术文献
8、非专利文献
9、非专利文献1：urano，et al.，thrombosis and haemostasis，1990，vol.63，p.82-86.
10、非专利文献2：urano，et al.，thrombosis and haemostasis，1991，vol.66，p.474-478.
11、非专利文献3：urano，et al.，european journal of biochemistry，1992，vol.209，p.985-992.
12、非专利文献4：dong et al,thrombosis research,1993,vol.69,p.491-499.
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、在溶栓疗法中，对于血液中纤溶因子的浓度偏离正常值的患者，也需要一种简便地测定各患者的血浆中的pai-1及α2ap的抗纤维蛋白溶解活性的方法，以确定安全且有望充分溶栓的pas剂量。另外，在抗纤溶疗法中，为了掌握纤溶抑制因子的消耗性降低，恰当地掌握纤溶亢进病况，测定血浆中pai-1及α2ap的抗纤维蛋白溶解活性也是非常重要的。因此，本发明的目的在于提供一种简便地评估血浆中pai-1及α2ap的残存抗纤维蛋白溶解活性的方法。
3、解决问题的方案
4、本发明人们发现，通过在用sds处理过的血浆中添加tpa，在triton x-100的存在下使血浆凝块溶解，即使在pai-1及α2ap的存在下也不受pai-1及α2ap活性的影响，可以测定pa依赖性的血浆凝块溶解时间及测定荧光基质的纤溶酶生成速度，从而完成了本发明。
5、即，本发明如下所述。
6、[1]一种评估受试动物的抗纤维蛋白溶解活性的方法，具有如下的工序：
7、预处理工序，在源自所述受试动物的一部分血浆中添加阴离子型表面活性剂并孵育规定时间；
8、第一抗纤维蛋白溶解性测定工序，对于通过所述预处理工序获得的处理后血浆，测定pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性的指标值；
9、第二抗纤维蛋白溶解性测定工序，对于源自所述受试动物的一部分血浆，测定pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性的指标值；
10、评估工序，基于在所述第一抗纤维蛋白溶解性测定工序中测定的指标值和在所述第二抗纤维蛋白溶解性测定工序中测定的未处理血浆的指标值，评估所述受试动物的血浆中的pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性，
11、所述指标值为在非离子型表面活性剂和纤溶酶原激活剂的存在下直至由凝血酶形成的血浆凝块溶解的时间，或在非离子型表面活性剂与纤溶酶原激活剂的存在下添加凝血酶时的纤溶酶生成速度。
12、[2]根据所述[1]所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，所述阴离子型表面活性剂为sds。
13、[3]根据所述[2]所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，通过在所述一部分血浆中添加0.01～0.1w/v％的sds并处理5～30分钟来进行所述预处理工序。
14、[4]根据所述[1]～[3]中任一项所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，所述非离子型表面活性剂为triton x-100。
15、[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，
16、所述指标值为在非离子型表面活性剂与纤溶酶原激活剂的存在下直至由凝血酶形成的血浆凝块溶解的时间，
17、所述第一抗纤维蛋白溶解性测定工序、所述第二抗纤维蛋白溶解性测定工序、及所述评估工序，分别为：
18、第一溶解时间测定工序，在通过所述预处理工序获得的处理后血浆中添加非离子型表面活性剂和纤溶酶原激活剂之后，进而添加凝血酶，在形成血浆凝块后，测定从添加所述凝血酶的时间点到形成的血浆凝块溶解的时间；
19、第二溶解时间测定工序，在源自所述受试动物的一部分血浆中添加所述非离子型表面活性剂与纤溶酶原激活剂之后，进而添加凝血酶，在形成血浆凝块之后，测定从添加所述凝血酶的时间点到形成的血浆凝块溶解的时间；以及
20、评估工序，基于在所述第一溶解时间测定工序中测定的处理后血浆的血浆凝块的溶解时间和在所述第二溶解时间测定工序中测定的未处理血浆的血浆凝块的溶解时间的差，评估所述受试动物的血浆中的pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性，
21、在所述第二溶解时间测定工序中向所述未处理血浆中添加的所述非离子型表面活性剂、所述纤溶酶原激活剂、及所述凝血酶的浓度等于在所述第一溶解时间测定工序中向所述处理后血浆中添加的所述非离子型表面活性剂、所述纤溶酶原激活剂、及所述凝血酶的浓度。
22、[6]根据所述[5]所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，
23、所述非离子型表面活性剂为triton x-100，
24、在1.0v/v％的triton x-100的存在下进行所述第一溶解时间测定工序和所述第二溶解时间测定工序中的血浆凝块的形成。
25、[7]根据所述[5]或[6]的所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，在两种以上不同浓度的所述纤溶酶原激活剂的存在下，进行所述第一溶解时间测定工序和所述第二溶解时间测定工序中的血浆凝块的形成，
26、在所述评估工序中，基于在所述第一溶解时间测定工序中测定的处理后血浆的血浆凝块的溶解时间和在所述第二溶解时间测定工序中测定的未处理血浆的血浆凝块的溶解时间的差，评估所述受试动物的血浆中的pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性。
27、[8]根据所述[1]～[4]中的任一项所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，
28、所述指标值是非离子型表面活性剂和纤溶酶原激活剂的存在下添加凝血酶时的纤溶酶生成速度，
29、所述第一抗纤维蛋白溶解性测定工序、所述第二抗纤维蛋白溶解性测定工序、及所述评估工序，分别为：
30、第一纤溶酶生成速度测定工序，在通过所述预处理工序获得的处理后血浆中添加非离子型表面活性剂、纤溶酶原激活剂、及纤溶酶荧光基质之后，进而添加凝血酶，形成血浆凝块之后，测定从添加所述凝血酶的时间点开始的纤溶酶生成速度；
31、第二纤溶酶生成速度测定工序，在源自所述受试动物的一部分血浆中添加非离子型表面活性剂、纤溶酶原激活剂、及纤溶酶荧光基质之后，进而添加凝血酶，在形成血浆凝块之后，测定从添加所述凝血酶后的时间点开始的纤溶酶生成速度；以及
32、评估工序，基于在所述第一纤溶酶生成速度测定工序中测定的处理后血浆的纤溶酶生成速度相对于在所述第二纤溶酶生成速度测定工序中测定的未处理血浆的纤溶酶生成速度的比，评估所述受试动物的血浆中的pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性，
33、在所述第二纤溶酶生成速度测定工序中向所述未处理血浆中添加的所述非离子型表面活性剂、所述纤溶酶原激活剂、所述纤溶酶荧光基质、及所述凝血酶的浓度等于在所述第一纤溶酶生成速度测定工序中向所述处理后血浆中添加的所述非离子型表面活性剂、所述纤溶酶原激活剂、所述纤溶酶荧光基质、及所述凝血酶的浓度。
34、[9]根据所述[8]所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，所述纤溶酶生成速度是将从添加凝血酶的时间点开始的荧光亮度值的变化量除以从添加凝血酶的时间点开始的经过时间的平方得到的值。
35、[10]根据所述[8]或[9]所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，
36、所述非离子型表面活性剂为triton x-100，
37、在1.0v/v％的triton x-100的存在下进行所述第一纤溶酶生成速度测定工序与所述第二纤溶酶生成速度测定工序中的血浆凝块的形成。
38、[11]一种确定溶栓疗法中的纤溶酶原激活剂的剂量的方法，
39、对来自进行了溶栓疗法的患者的血浆进行所述[1]～[10]中任一项所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，基于获得的评估结果，确定溶栓疗法中的纤溶酶原激活剂的剂量。
40、[12]一种确定抗纤溶疗法中可否施用氨甲环酸的方法，
41、对来自进行了抗纤溶疗法的患者的血浆进行所述[1]～[10]中任一项所述的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，基于获得的评估结果，确定抗纤溶疗法中可否施用氨甲环酸。
42、发明效果
43、通过使用本发明的评估血浆中抗纤维蛋白溶解活性的方法，能够简便地评估血浆中的pai-1及α2ap所致的抗纤维蛋白溶解活性。因此，通过使用该评估方法，在溶栓疗法中，能够非常简便地确定安全且可期待获得充分的药效的最优的纤溶酶原激活剂(pas)的剂量。另外，该评估方法对抗纤溶疗法中可否施用氨甲环酸非常有用。