一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

本发明涉及nt5c1a-ab测定，特别涉及一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒。

背景技术：

1、特发性炎性肌病（idiopathic inflammatory myopathies,iim）是一大类以慢性肌肉炎症为主要特征的自身免疫性疾病，临床上以四肢近端肌肉受累为突出表现，可出现肌无力、血清肌酸激酶的升高，同时血清中可出现一系列的自身抗体。除此之外，iim患者还常出现其他重要脏器的累及，包括皮肤、肺脏、心脏、关节、消化道等，10%-40%患者可合并有恶性肿瘤，表现出强烈的异质性。iim导致的残疾可严重影响患者的生存质量，而出现多系统受累的患者整体预后很差，研宄显示其死亡率达12%-60%，因此这一疾病也越来越受到关注。

2、根据临床表现和病理学特征的不同，可将iim分为以下几大亚型：多发性肌炎（polymyositis,pm）、皮肌炎（dermatomyositis,dm）、免疫介导的坏死性肌炎（immune-mediatednecrotizing myopathy,imnm）、非特异性肌炎（nonspecificmyositis,nsm）和包涵体肌炎（inclusion body myositis,sibm）。这些疾病既有相同的临床表现，有各自有特殊的表型，可能与其不同的发病机制有关。近年的一些研究发现一些自身抗体与特殊的临床表型有一定的相关性，因而肌炎患者经常有与不同的临床表型相关的自身抗体。仅在肌炎患者中发现的自身抗体被称为肌炎特异性自身抗体(msas)，而在其他自身免疫疾病中发现的自身抗体被称为肌炎相关自身抗体(maas)。包涵体肌炎(ibm)是一种特发性炎症性肌病(iim)，通常影响年龄在50岁以上的患者。ibm患者的临床特征是不对称的手指屈伸无力和膝关节伸展无力。2013年，在ibm患者的血清中检测到抗胞质5‘-核苷酸酶1a(nt5c1a)抗体，并被认为为ibm的潜在诊断标志物。自2014年以来，华盛顿大学神经肌肉临床实验室已将抗nt5c1a抗体测试纳入其肌炎分离抗体测试。2016年，研究者发现一种针对43kd蛋白的血清抗体似乎在sibm（散发型包涵体肌炎）患者中很常见；该自身抗体可以与该蛋白nt5c1a结合，该蛋白在骨骼肌中最为丰富，可能在dna修复中发挥作用。随后，在皮肌炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮患者中检测到该抗体。这表明抗nt5c1a可以在除ibm以外的自身免疫性疾病中检测到。在ibm或皮肌炎中，抗nt5c1a的血清阳性与其他临床病理特征之间的关系已经被讨论，一些报道称，在ibm或幼年、青少年肌炎中，抗nt5c1a的血清阳性可以预示更严重的表型。抗nt5c1a抗体在普通人群中很少见，在除sibm以外的炎症性肌病中出现的频率较低。抗nt5c1a抗体的致病作用尚不清楚。研究数据表明，具有nt5c1a抗体的血清阳性sibm可能代表一种更具侵袭性的疾病，有更严重的运动和功能缺陷，球部和呼吸受累的发生率更高。

3、目前，对于抗nt5c1a抗体的检测多是采用wb方法，但由于其难以维持蛋白的空间构象，致使其特异性不高，且费用昂贵，时间也很长，极大的限制了这些检测手段的推广，因而建立该抗体的检测方法并研制自身免疫性脑炎抗体体外诊断试剂，对于检测患者血清中抗体对该肌病的诊断具有重要意义。为此，我们提出一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒，通过构建带有荧光标签的nt5c1a真核表达载体，并利用脂质体转染的方式建立基于hek293细胞的双色间接免疫荧光方法，制备抗nt5c1a抗体细胞，测定患者血清中抗nt5c1a抗体，可以有效解决背景技术中的问题。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒，所述的检测方法包括以下步骤：

4、步骤一，提取人肌肉组织总rna及获得总cdna

5、从临床中获取人肌肉组织，采用trizol试剂提取rna，在多功能酶标仪上检测rna浓度及纯度，用depc处理水校正零点；用depc处理水稀释rna样品；读取od260、od280值和od260/od280的比值，当od260/od280的比值范围在1.8-2.0时，进行反转录反应，获取cdna；

6、步骤二，构建重组表达psjmy-nt5c1a-gfpc载体

7、根据nt5c1a序列设计nt5c1a基因扩增引物，利用已设计合成好的引物进行rt-pcr获取人nt5c1a基因，将rt-pcr扩增产物nt5c1a与t载体进行ta克隆，将大小位置正确的转化子接菌，培养，提取质粒，限制性酶切及测序鉴定，挑选正确的转化子进行重组组合，从t载体上切胶回收，插入到c端含有gfp绿色荧光标签的空载体psjmy-gfpc、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，以上下游引物对转化子进行菌落扩增，培养重组克隆成功的转化子，提取质粒，进一步通过目的基因pcr、限制性酶切、基因测序等方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌；

8、步骤三，制备含重组表达载体psjmy-nt5c1a-gfpc的细胞

9、接种hek293t细胞至24孔培养板及腔室载玻片系统培养24h，当细胞达80％融合时采用turbo8.0转染试剂进行转染，分别将psjmy-nt5c1a-gfpc载体与转染试剂按照质量体积比0.1ug:0.3ul转入hek293t细胞，放至co2培养箱培养48h后，荧光显微镜下观察转染效率并记录、拍照，当转染效率达到60%-80%，将转染细胞弃上清，使用pbs清洗一遍细胞，弃pbs，用多聚甲醛固定细胞20min后，再使用pbs清洗2遍，加入含triton、bsa进行破膜及封闭3小时至过夜，从而得到通透的含重组表达载体psjmy-nt5c1a-gfpc的细胞

10、步骤四，构建并验证cba间接免疫荧光法

11、构建步骤：

12、a.将兔源一抗按照1：400-1:1000的比例进行稀释；

13、b.转染细胞表面封闭液弃去，加入稀释后的兔源一抗，37℃环境下孵育30min-2h；

14、c.用含triton的pbs洗液洗涤；

15、d.加入alexa fluor® 594二抗，孵育30min-2h；

16、e.含triton的pbs洗液洗涤；

17、f.加入一定体积的磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照；

18、g.对转染细胞提取全蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，验证重组表达载体在细胞中nt5c1a蛋白表达情况。

19、步骤五，筛选应用于临床血清标本nt5c1a抗体

20、通过步骤四构建的cba间接免疫荧光法测定人血清中的抗nt5c1a抗体情况，根据免疫荧光图进行临床阳性判定，具体步骤为：

21、a.获取临床患者的血清样本，并对血清标本进行比例稀释。

22、b.弃去转染细胞表面封闭液，加入稀释后的血清样本，37℃环境下孵育30min-2h；

23、c.用含triton的pbs洗液洗涤；

24、d.加入alexa fluor® 594二抗，孵育30min-2h；

25、e.含triton的pbs洗液洗涤；

26、f.加入一定体积的磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照，获取免疫荧光图；

27、g.根据免疫荧光图的显色情况进行临床阳性判定，判定方法为：psjmy-nt5c1a-gfpc转染hek293t细胞后，gfp和nt5c1a融合显示绿色荧光，抗nt5c1a血清抗体与转染的nt5c1a蛋白结合，在alexa fluor® 594二抗作用下，显示红色荧光，若绿色荧光和红色荧光merge后荧光呈黄色，则证明抗体阳性，否则为阴性。

28、进一步的，所述步骤二中nt5c1a基因扩增引物的序列为：

29、224617nt5c1a-f：5’-aatgcgatcgccatggaacctgggcagc-3’

30、224617nt5c1a-s：5’-taaacgcgtctgtgcagatggggcctgct-3’。

31、进一步的，所述步骤一中采用trizol试剂提取rna具体步骤为：

32、a.取新鲜人肌肉组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的trizol液1ml于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织，然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mlep管中，于室温下静置5min；

33、b.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min；

34、c.于4℃环境下，10000r/min离心处理15min，使rna分布于水相中；

35、d.将上层无色水相转移到另一ep管中，加入500μl异丙醇，室温静置10min；

36、e.于4℃环境下，10000r/min离心处理10min；

37、f.弃上清液，用1ml75%乙醇洗涤rna沉淀物，于4℃环境下，7500r/min离心处理5min；

38、g.弃上清液，室温干燥15min；

39、h.向干燥过的沉淀物中加入200μldepc处理水溶解沉淀物，于-20℃保存备用。

40、进一步的，所述的体外诊断试剂盒依据上述方法制备。

41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

42、（1）本发明通过构建带有荧光标签的nt5c1a真核表达载体，并利用脂质体转染的方式建立基于hek293细胞的双色间接免疫荧光方法，制备抗nt5c1a抗体细胞，测定患者血清中抗nt5c1a抗体，可以最大限度的维持蛋白的空间构象，提高检测的特异性，对患者的早期诊断和疗效评价均有明确的指导意义，且该方法中所使用的试剂均为常规试剂，便于获得，降低了检测试剂盒的成本，具有显著的社会效益。