一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法及其应用

本发明属于电生理记录，具体涉及一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法及其应用，以及所涉及的中老年小鼠脑切片用人工脑脊液acsf。

背景技术：

1、离体脑切片是指用小鼠脑组织制备的厚度为100～500微米的活组织切片。离体脑切片不仅一定程度上具有在体脑的特性，而且与在体脑相比，还排除了血脑屏障的阻隔以及由于心脏搏动、呼吸运动等导致的机械稳定性欠佳等问题。重要的是，离体脑切片的外环境容易控制，非常适合于生理学和药理学研究。在基础和临床的神经领域研究中，离体脑切片的电生理记录是一种广泛使用的技术手段。然而，由于在电生理记录时需要保持离体脑切片具有较好的生理活性，一般只能选择耐缺氧能力以及可塑性较强的小于3周龄的幼年动物脑组织作为实验对象，这就对一些需要中老年动物脑组织作为实验对象的电生理研究，比如衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病的研究带来了极大的挑战。

2、大量的研究表明，长时程突触可塑性包括长时程突触增强(long-termpotentiation,ltp)是学习和记忆的细胞突触机制。然而神经网络层面上突触可塑性的记录不同于一般电生理指标的记录，通常会在几分钟至多十几分钟内就能完成，一轮完整的ltp记录至少需要持续2小时以上的信号采集，在此过程中，需要始终保持记录用的离体脑切片具备良好的生理活性，更是加大了此类电生理记录的难度。因此，长期以来，提高并维持足够长时间的中老年动物离体脑切片的生理活性就成为电生理记录技术的一个瓶颈问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，以克服现有技术条件下离体脑片电生理记录仅能选择幼年动物脑组织作为实验对象，导致在一定程度上制约了需要使用中老年动物脑切片作为实验对象的一些与衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病相关研究的开展。

2、本发明提供了一种中老年小鼠脑切片用人工脑脊液acsf(artificialcerebralspinal fluid)，其包括两种，一是用于制取中老年小鼠脑切片时的人工脑脊液sacsf(sectionacsf)；和/或，另一是用于电生理记录时孵育中老年小鼠脑切片的人工脑脊液cacsf(cultureacsf)。

3、其中，所述sacsf包含n-甲基-d-葡萄糖胺(60～63mm)、氯化胆碱(29～32mm)、氯化钾(2.3～2.6mm)、碳酸氢钠(26～29mm)、磷酸二氢钠(1.0～1.3mm)、hepes(18～21mm)、d-葡萄糖(23～26mm)、硫脲(1.8～2.1mm)、抗坏血酸钠(4.8～5.1mm)、丙酮酸钠(2.8～3.1mm)、硫酸镁(9.8～10.1mm)、氯化钙(0.48～0.51mm)、环磷腺苷钠(1.8～2.1mm)和n-乙酰半胱氨酸(10～13mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l；优选地，所述sacsf包含n-甲基-d-葡萄糖胺(62mm)、氯化胆碱(31mm)、氯化钾(2.5mm)、碳酸氢钠(28mm)、磷酸二氢钠(1.2mm)、hepes(20mm)、d-葡萄糖(25mm)、硫脲(2mm)、抗坏血酸钠(5mm)、丙酮酸钠(3mm)、硫酸镁(10mm)、氯化钙(0.5mm)、环磷腺苷钠(2mm)和n-乙酰半胱氨酸(12mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l。

4、其中，所述cacsf包含氯化钠(91～94mm)、氯化钾(2.3～2.6mm)、碳酸氢钠(26～29mm)、磷酸二氢钠(1.0～1.3mm)、hepes(18～21mm)、d-葡萄糖(23～26mm)、硫脲(1.8～2.1mm)、抗坏血酸钠(4.8～5.1mm)、丙酮酸钠(2.8～3.1mm)、硫酸镁(1.8～2.1mm)、氯化钙(2.3～2.6mm)和环磷腺苷钠(1.8～2.1mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l。优选地，所述cacsf包含氯化钠(93mm)、氯化钾(2.5mm)、碳酸氢钠(28mm)、磷酸二氢钠(1.2mm)、hepes(20mm)、d-葡萄糖(25mm)、硫脲(2mm)、抗坏血酸钠(5mm)、丙酮酸钠(3mm)、硫酸镁(2mm)、氯化钙(2.5mm)和环磷腺苷钠(2mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l。

5、本发明还提供了一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，其能够显著提高并维持长时间的中老年小鼠离体脑切片的生理活性，为后续突触传递和突触可塑性等电生理指标的记录提供高质量的中老年小鼠脑切片样本。

6、本发明还提供了一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，所述制备方法中使用所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液acsf；所述制备方法包括如下步骤：

7、步骤1)：将脑组织放入冷却至冰水混合物状态的氧饱和的切片用人工脑脊液所述sacsf中进行脑组织冷却和切片；

8、步骤2)：将步骤1)得到脑组织切片迅速转移至31℃氧饱和的孵育用人工脑脊液所述cacsf中复苏。

9、在一具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

10、1)小鼠麻醉断头取脑后迅速将脑组织放入冷却至冰水混合物状态的氧饱和切片用人工脑脊液(sacsf)中进行脑组织冷却和切片，其中sacsf包含n-甲基-d-葡萄糖胺(62mm)、氯化胆碱(31mm)、氯化钾(2.5mm)、碳酸氢钠(28mm)、磷酸二氢钠(1.2mm)、hepes(20mm)、d-葡萄糖(25mm)、硫脲(2mm)、抗坏血酸钠(5mm)、丙酮酸钠(3mm)、硫酸镁(10mm)、氯化钙(0.5mm)、环磷腺苷钠(2mm)和n-乙酰半胱氨酸(12mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l；

11、2)切好的脑片迅速转移至31℃氧饱和的孵育用人工脑脊液(cacsf)中复苏1小时，其中cacsf包含氯化钠(93mm)、氯化钾(2.5mm)、碳酸氢钠(28mm)、磷酸二氢钠(1.2mm)、hepes(20mm)、d-葡萄糖(25mm)、硫脲(2mm)、抗坏血酸钠(5mm)、丙酮酸钠(3mm)、硫酸镁(2mm)、氯化钙(2.5mm)和环磷腺苷钠(2mm)，ph值为7.3～7.4，渗透压为300～310mosm/l；

12、3)电生理记录时使用27±2℃氧饱和的cacsf持续灌流上述得到的中老年小鼠脑切片，灌流速度为2～3ml/min。

13、本发明还提供了以所述方法制备得到的中老年小鼠脑切片。其在膜片钳记录中具有较高的高阻封接能力(不小于1gω)；在场电位记录中具有较好的突触传递能力，如最大电刺激诱导的兴奋性突触后电流不小于0.4mv；和/或，在场电位记录中具有较好的突触可塑性，如长时程突触增强不小于120％。

14、本发明制备得到的中老年小鼠脑切片具有电生理活性高，活性持续时间长等特点，为后续突触传递和突触可塑性等电生理指标的记录提供了保证。

15、本发明还提供了上述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液sacsf和cacsf的制备方法，所述制备方法包括：

16、1)分别称量n-甲基-d-葡萄糖胺、氯化胆碱、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、hepes、d-葡萄糖、硫脲、抗坏血酸钠、丙酮酸钠、环磷腺苷钠、n-乙酰半胱氨酸、硫酸镁和氯化钙，加水溶解，配置sacsf溶液，其中硫酸镁和氯化钙最后添加，并且一个溶解完全后再溶解另外一个；

17、2)分别称量氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、hepes、d-葡萄糖、硫脲、抗坏血酸钠、丙酮酸钠、环磷腺苷钠、硫酸镁和氯化钙，加水溶解，配置cacsf溶液，其中硫酸镁和氯化钙最后添加，并且一个溶解完全后再溶解另外一个；

18、3)向步骤1)和2)得到的溶液中加入盐酸调节ph至7.3～7.4，得到所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液sacsf和cacsf。

19、本发明还提供了所述制备方法、以及由上述制备方法制备得到的中老年小鼠脑切片、以及所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液acsf在电生理记录中的用途，所述用途包括但不限于在电生理指标包括刺激强度-反应曲线(input-outputcurve)和突触可塑性记录中的用途。

20、与现有技术相比，本发明在切片制备过程中通过配合使用两种acsf溶液，能够显著提升中老年小鼠脑切片的质量并记录出高质量的相关电生理指标，如从能够诱导出的最大fepsp来看，传统方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fepsp幅度显著降低，但本发明提供的方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fepsp幅度始终保持较高的水平(见图2)。另外，在中老年小鼠中，使用传统方法制备的脑切片已经很难再诱导出ltp，而本发明提供的方法制备的脑切片仍然能够诱导出显著的ltp(图3)。这些数据说明本发明提供的方法制备的脑切片能够很好地保持局部环路的突触可塑性，这为衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病的电生理研究提供了高质量的样本保障。