一种DNA纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物传感，具体为一种dna纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用。

背景技术：

1、侧流层析试纸条(lateral flow test strips，lfts)是一种重要的即时传感检测(point-of-care testing，poct)平台。由于其便携性、可靠性、易用性、快速检测时间和成本效益的优越性，试纸条式传感器在当地诊所、家庭诊断、区域机场和偏远地区显示出巨大的潜力，供这些地区由未经培训的人员在仪器资源有限的情况下使用。除了最著名的家庭妊娠试验外，lfts还被广泛用作肿瘤的快速检测、细菌、病毒和毒素等。特别是，lfts作为目前最有前途的现场即时形式，在针对具有高度传染性的sars-cov 2病毒的快速诊断方面显示巨大应用价值。在这些传感策略中，常用的lfts测定形式是基于抗体-抗原反应的夹心和竞争性测定，称为侧流免疫测定(lateral flow immunoassay，lfia)。然而，在lfia中使用抗体作为传感元件通常存在一些限制，包括生产成本高，生产时间长和热稳定性差。此外，针对非免疫原性或毒性靶标的抗体生产很困难。最近，研究人员试图采用基于核酸的传感策略作为替代方案。这种适配体(通过指数富集程序对配体的系统进化选择的独特核苷酸)代替抗体，用于检测非核酸靶标。同时，lfts中已采用多种核酸扩增策略来灵检测与人类和环境健康有关的肿瘤和病原体的核酸和非核酸靶标。测试中使用的寡核苷酸具有高重现性、高稳定性和低生产成本的特点，并且易于用官能团修饰或定制，包括分裂、删除、取代、融合和伸长，从而在很大程度上解决了抗体依赖性侧流免疫测定中存在的局限性。在基于核酸的lfts中，合成的寡核苷酸通常被设计为测试线和质控线上的条形码，用于识别捕获偶联物、生物识别元件或扩增元件。然而，条形码捕获探针需要提前与蛋白质分子连接形成蛋白-核酸复合物，以避免其随着样品流过而自我移动。即使用作识别或扩增元件，寡核苷酸也通常需要用至少一种功能分子修饰，以与固定在传感界面区的抗体或链霉亲和素发生反应。考虑识别捕获步骤时对，lfts传感界面构建对抗体或其他蛋白分子的依赖性使得其应用不太实用或用户不友好性。从理论上讲，lfts的多分析物检测能力受到在传感界面区作为捕获分子的抗体种类的限制。

2、dna纳米技术是一种纳米级的自组装技术，使用dna分子作为构建块和dna可编程性，结合降低成本和提高dna合成质量，使我们能够合理设计和精确控制核酸分子电路、机器和纳米结构。在dna电路中，催化发夹组装(cha)电路是一种有吸引力的等温扩增方法，用于体外诊断中目标靶标的无酶、高效和扩增检测，rna成像(青等人，2021；li等人，2022)或活细胞中其他核酸适体识别的分子的传感检测。通过引入触发序列，cha电路通过一系列链位移反应进行发夹结构连续打开和组装的程序化过程，从而在短时间内实现基于cha的等温信号放大。dna四面体(dnatetrahedron，dt)是由四个单链dna组装的最简单的dna多面体之一，最初由turberfield及其同事报道。这种立体结构表现出卓越的特性，包括出色的寻址性、可控性、货物装载能力、生物相容性和稳定性。目前其已应用于电化学平台，用于检测核酸、蛋白质、小分子和细胞。进一步，dt已扩展到包括荧光检测在内的各种生物传感策略，电化学发光，晶体管传感器，光电化学生物传感器，细胞内成像，细胞膜监测，亚细胞蛋白分布的多重分析。

3、然而，dna四面体(dnatetrahedron，dt)尚未被提出和探索开发应用在侧流层析试纸条生物传感界面构建。侧流层析试纸条(lfts)作为极其简便而有应用价值的快速诊断技术，本发明首次在侧流层析试纸条检测平台设计并构建dna四面体纳米结构探针传感界面，并通过实验研究探索和证实一种dna纳米结构探针传感界面构建新方法。该dna纳米结构探针方法解决了侧流层析试纸条寡核苷酸传感界面构建中对抗体或链霉亲和素等蛋白分子的依赖性，极大的提高了基于核酸策略试纸条的应用简便性和应用拓展性。通过程序化设计或化学修饰等策略可构建多种dna纳米结构探针传感界面，以实现核酸标志物及细胞、蛋白质和小分子等多种非核酸靶标特异检测。进一步，结合不同核酸放大策略，在dna纳米结构探针传感界面可实现核酸标志物和非核酸标志物的超灵敏检测。

4、外泌体为平均直径为30-150nm的囊泡结构，为液体活检的重要生物标志物。外泌体microrna(exo-mirna)作为外泌体中的一种核酸成分可能提供多组分子诊断信息。我们首次提出了侧流层析试纸条硝酸纤维素膜上构建基于dna纳米结构探针传感界面，以固定流过的功能化纳米金颗粒(aunps)，并通过将dna四面体纳米结构探针传感界面与cha等温放大技术联用，开发了一种比率计试纸条用于来灵敏检测exo-mirna。通过利用dt特性的优点，如空间可控性、稳定性、探针负载能力和探针对核酸酶介导降解的保护能力，纳米结构探针易于与设计的链霉亲和素化的胶体金(sa-aunps)发生超链接反应，在测试区和质控区形成红线。dna纳米结构探针解决了核酸捕获探针随样品自移动的问题。cha等温放大技术在exo-mirna检测中增强了可视化信号。比率计试纸传感器使我们能够用肉眼读取exo-mirna的浓度或使用试纸条分析器高灵敏度地定量exo-mirna。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种dna纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备及其应用。

2、为达到上述目的，采用的技术方案为：

3、一种基于dna纳米结构捕获探针侧流层析试纸条的制备方法，其特征是，包含以下步骤：

4、1)胶体金纳米粒子的合成与修饰

5、通过柠檬酸盐还原haucl4溶液，制备合成球形胶体金纳米粒子aunps，将aunps与k2co3溶液与链霉亲和素混合，浓度分别为0.5mm和2μg/ml；然后将混合物在混合器上摇动60min，在室温下加入终质量浓度为0.1％的牛血清白蛋白作为封闭剂封闭20min；再将混合物以12000rpm离心15min收集红色沉淀，即得到链霉亲和素修饰的胶体金纳米粒子sa-aunps；

6、2)四面体纳米结构探针的制备

7、针对dna四面体四条链进行捕获探针的核酸编码设计，使捕获探针区与发夹探针h1上的部分区域序列互补；在95℃下将用于形成四面体纳米结构探针的四条链进行等摩尔量混合于缓冲液20mm tris，50mm mgcl2，ph 8.0，然后冷却至4℃；

8、3)试纸条的制备

9、该层流层析试纸条由四个部分组成：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；四个组件都安装在一个共同的背衬层上；将玻璃纤维制成的样品垫浸泡在含有20mm tris-hcl、0.5％吐温-20、质量浓度2.0％的蔗糖和150mm nacl ph 7.3的缓冲液中；然后，将样品垫在37℃下干燥2小时；通过将5μl链霉亲和素标记的胶体金溶液sa-aunps分配到玻璃纤维垫上来制备金标垫，将垫子在35℃下干燥1小时然后在4℃下储存；

10、构建dna四面体纳米探针传感界面，使用移液器将1μl四面体捕获探针作为点滴在测试区域，然后将膜在37℃下干燥1小时，再将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在具有1-2mm重叠位置的塑料胶背衬上，再将组装好的板切成3毫米宽的试纸条，即可。

11、进一步，所述步骤3)中，构建dna四面体纳米探针传感界面，包含测试区和质控区检测线，由hm3035 xyz平台分配器执行，分别以2μl/cm的速度分配2μm dna四面体纳米结构探针或2μm生物素化四面体纳米结构探针，测试区和质控区之间的距离约为5mm。

12、以及上述基于dna捕获探针的侧流层析试纸条用于外泌体microrna的可视化检测的应用。

13、本发明基于dna四面体纳米结构探针和催化发夹自组装，提出了一种新型的比率计试纸条传感器。该传感器在测试线中增加了红色可视化信号强度，在质控线中减少了红色可视化信号。dna四面体已被广泛用于探索各种生物传感器，用于体外诊断以及细胞和细胞表面的原位检测。目前，dna纳米结构探针尚未用于侧向层析试纸中，而侧流层析试纸是临床中实际检测不同目标物种的非常重要的快速传感检测平台。本研究首先提出了一种利用dna四面体纳米结构探针在试纸条传感检测区制备传感检测界面的新方法，解决了核酸探针须与蛋白质分子连接形成大分子复合物的制备难题。由于采用了cha电路和比率策略，在100fm至10nm的宽线性范围内实现了54.75fm的最低检测限。该试纸条生物传感器在外泌体microrna-150-5p的实际检测中表现出较高的灵敏度和巨大的应用潜力。因此，所发现验证的dna纳米结构探针提供了一种在试纸平台上构建生物传感界面的通用方法，可应用与核酸标志物检测及细胞、外泌体、蛋白和小分子等非核酸标志物检测，具有优良的应用现场分析或床旁检测前景。所构建比率计试纸条为外泌体microrna检测提供了一种poct型检测新方法。