一种水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱的构建方法与流程

本发明属于中药质量检测，具体涉及一种水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱的构建方法。

背景技术：

1、水蛭为水蛭科动物蚂蟥whitmania pigra whitman、水蛭hirudo nipponicawhitman或柳叶蚂蟥w.acranulata whitman的干燥全体，为2020版《中国药典》收载的常用中药材，具有破血通经、逐瘀消癥之功效。临床主要用于血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌扑损伤等症。

2、目前，全世界约有500余种水蛭，2020版《中国药典》规定了水蛭的三种基原，分别为水蛭科动物蚂蟥whitmania pigra whitman、水蛭hirudo nipponica whitman或柳叶蚂蟥w.acranulata whitman。此三种水蛭在分类学上均属真蛭亚纲、无吻蛭目(arhynchobdellida)，其中蚂蟥w.pigra又称宽体金线蛭，柳叶蚂蟥w.acranulata又称尖细金线蛭，同属于黄蛭科(haemopidae)；水蛭h.nipponica又称日本医蛭，属于医蛭科(hirudinidae)。本发明以2020年版《中国药典》中所属水蛭科蚂蟥记录为准。

3、烫水蛭(蚂蟥)为水蛭(蚂蟥)经滑石粉烫制而得的炮制品，由于经过烫制后，生品与炮制品间会存在活性成分的差异，因此对生熟异治的研究，在中药质量的控制中具有实际意义。

4、目前市场上的水蛭种类繁多，不同基原水蛭之间会存在活性成分的差异，根据“国家药监局《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(2021年第16号)”的要求，不同基原的中药材不可相互混用，因此，鉴别不同基原的水蛭势在必行。因此，对同品种不同基原的鉴别，对于监控中药质量也具有实际意义。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的在于提供水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱的构建方法，该方法能够分别构建水蛭药材、水蛭饮片、水蛭饮片标准汤剂、水蛭配方颗粒、烫水蛭饮片、烫水蛭饮片标准汤剂或烫水蛭配方颗粒的特征图谱，不仅可用于准确鉴别水蛭及其药物制剂与烫水蛭及其药物制剂，还可用于鉴别水蛭及其药物制剂与常见混伪品，以及烫水蛭与常见混伪品，能够对水蛭(蚂蟥)、烫水蛭(蚂蟥)进行全面而有效的鉴别。

2、为此，本技术提供了一种水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

3、供试品溶液的制备：称取供试品，加入提取溶剂进行提取，制备供试品溶液；

4、测定：取所述供试品溶液采用超高效液相色谱法检测，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为甲醇，流动相b为ph值为3.9-4.1，浓度为0.0095-0.0105mol/l的甲酸铵水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。

5、进一步地，所述梯度洗脱包括如下程序：

6、0～10min，流动相a的体积分数由15％上升至31％；流动相b的体积分数变化由85％下降至69％；

7、10～16min，流动相a的体积分数变化由31％上升至35％，流动相b的体积分数变化由69％下降至65％；

8、16～25min，流动相a的体积分数变化由35％上升至42％，流动相b的体积分数变化由65％下降至58％；

9、25～35min，流动相a的体积分数变化由42％上升至45％，流动相b的体积分数变化由58％下降至55％；

10、35～46min，流动相a的体积分数变化由45％上升至60％，流动相b的体积分数变化由55％下降至40％。

11、进一步地，超高效液相色谱法检测中，流速每分钟0.19～0.21ml，柱温为28～32℃，检测波长为320nm-365nm，进样量为0.5～2μl；和/或，所述提取溶剂为30％-70％甲醇；和/或，所述梯度洗脱还包括如下程序：46～51min，流动相a的体积分数为60％，流动相b的体积分数为40％；51～52min，流动相a的体积分数变化由60％下降至15％，流动相b的体积分数变化由40％上升至85％；52～55min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％。

12、进一步地，还包括采用溶剂溶解水蛭胺c、水蛭胺b，维生素b2中的一种或者多种制备对照品溶液，并采用上述任一所述的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到参照物特征图谱的步骤，优选的，分别以水蛭胺c、水蛭胺b，维生素b2为对照品加30％-70％甲醇溶解，制得对照品溶液。

13、进一步地，供试品溶液的制备方法包括，称取供试品0.5g～1.5g(例如0.8g～1.2g)，精密加入30-70％甲醇10ml～50ml，称定重量，超声处理15-60分钟，放冷，再称定重量，用30-70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

14、进一步地，还包括将不同批次的水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱导入国家药典委员会颁布的中药色谱特征图谱相似度评价系统，生成水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的对照特征图谱，所述水蛭及其药物制剂的对照特征图谱具有10个特征峰，烫水蛭及其药物制剂的对照特征图谱具有12个共有特征峰，峰1为水蛭胺c，峰2为水蛭胺a，峰4为水蛭胺b，峰5为whitmanine b，峰7为维生素b2。

15、进一步地，所述水蛭及其药物制剂选自水蛭药材、水蛭饮片、水蛭饮片标准汤剂或水蛭配方颗粒；烫水蛭及其药物制剂选自烫水蛭饮片、烫水蛭饮片标准汤剂或烫水蛭配方颗粒，优选的，所述水蛭或烫水蛭的基原为蚂蟥。

16、进一步地，所建立的水蛭及其药物制剂的特征图谱具有10个共有特征峰，其中峰1与水蛭胺c参照物峰的保留时间相对应，以水蛭胺c参照物相应的峰为s峰，计算峰2～5、峰7、峰9～12与s峰的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，规定值为：1.66(峰2)、1.80(峰3)、2.30(峰4)、2.64(峰5)、3.24(峰7)、6.45(峰9)、6.97(峰10)、8.40(峰11)、8.69(峰12)；和/或，

17、所建立的烫水蛭及其药物制剂的特征图谱具有12个共有特征峰，其中峰1与水蛭胺c参照物峰的保留时间相对应，以水蛭胺c参照物相应的峰为s峰，计算峰2～12与峰1的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内，规定值为：1.66(峰2)、1.80(峰3)、2.30(峰4)、2.64(峰5)、2.93(峰6)、3.24(峰7)、4.11(峰8)、6.45(峰9)、6.97(峰10)、8.40(峰11)、8.69(峰12)；以水蛭胺c参照物相应的峰为s峰，计算峰6和峰8总峰面积与s峰的相对峰面积在规定值的范围内，规定值为：不得少于0.030。

18、本发明还提供了一种水蛭及其药物制剂与烫水蛭及其药物制剂的鉴别方法，包括：

19、使用待鉴别产品为供试品按照上述任一所述的构建方法构建得到待鉴别产品的特征图谱；

20、将所得待鉴别产品的特征图谱与上述任一所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，根据比对结果进行鉴别。

21、本发明还提供了一种蚂蟥基原的水蛭及其药物制剂与混伪品的鉴别方法，包括：

22、使用待鉴别产品为供试品按照上述任一所述的构建方法构建得到待鉴别产品的特征图谱；

23、将所得待鉴别产品的特征图谱与以蚂蟥基原的水蛭和/或水蛭药物制剂为供试品采用上述任一所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，根据比对结果进行鉴别，优选的，所述混伪品是基原为柳叶蚂蟥、菲牛蛭或日本医蛭的水蛭。

24、本发明还提供了一种蚂蟥基原的烫水蛭及其药物制剂与混伪品的鉴别方法，包括：

25、使用待鉴别产品为供试品按照上述任一所述的构建方法构建得到待鉴别产品的特征图谱；

26、将所得待鉴别产品的特征图谱与以蚂蟥基原的烫水蛭和/或烫水蛭药物制剂为供试品采用上述任一所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，根据比对结果进行鉴别，优选的，所述混伪品是基原为柳叶蚂蟥、菲牛蛭或日本医蛭的烫水蛭。

27、本发明还提供了一种水蛭及其药物制剂与烫水蛭及其药物制剂的质量检测方法，包括：使用待检测产品为供试品按照上述任一所述的构建方法构建得到待检测产品的特征图谱；

28、将所得待检测产品的特征图谱与上述任一所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，根据比对结果进行质量评价。

29、本发明技术方案，具有如下优点：

30、1.本发明所述的水蛭及其药物制剂或者烫水蛭及其药物制剂的特征图谱的构建方法，本发明构建了水蛭(蚂蟥)及其药物制剂的特征图谱，并确立了10个共有峰，峰的分离度好，基线平稳，峰形对称性好，充分展示了水蛭及其药物制剂的化学成分特征，为水蛭及其药物制剂的质量检测提供快速、全面的检测手段。

31、本发明构建了烫水蛭(蚂蟥)及其药物制剂的特征图谱，并确立了12个共有峰，峰的分离度好，基线平稳，峰形对称性好，充分展示了烫水蛭及其药物制剂的化学成分特征，为烫水蛭及其药物制剂的质量检测提供快速、全面的检测手段。

32、2、本发明所构建的水蛭及其药物制剂、烫水蛭及其药物制剂的特征图谱方法稳定，精密度高，重现性良好。

33、3、本发明所述的水蛭及其药物制剂与烫水蛭及其药物制剂鉴别方法专属性强，能够快速、准确地区分、鉴别水蛭及其药物制剂、烫水蛭及其药物制剂及其混伪品。