一种两性霉素B的超高效液相色谱分析方法

本发明属于药物分析，具体而言，涉及一种两性霉素b的超高效液相色谱分析方法。

背景技术：

1、两性霉素b(amphoteriein b)是结节性链丝菌产生的一种大环多烯类广谱抗真菌物，主要是通过选择性地与真菌细胞膜的麦角固醇结合改变了膜通透性而致真菌死亡，是目前最有效的抗真菌药物之一，但是由于其毒副作用较大，使其在临床上的应用受到限制。已有研究将其制备成脂质体、聚合物胶束等纳米制剂，可在一定程度上减轻其不良反应，为了保证两性霉素b新型制的后续研发和生产质量，需要对原料药及其新型制剂的质量进行控制。因此，研究两性霉素b含量测定的检测方法，这对医药行业来说至关重要。

2、专利cn110467645a中公开了一种分离提取高纯度两性霉素b的方法，该方法将烘干含有两性霉素b菌丝体投入萃取罐并加入甲醇和盐酸水溶液调节ph溶解两性霉素b，抽滤得到含有两性霉素b提取液并过膜除去热源和大分子物质，然后加入水和碱液调节ph使结晶沉淀，过滤干燥后得到两性霉素b固体，经hplc检测后，纯度超过93％，其出峰时间约为18分钟。

3、专利cn102382158a中公开了一种高纯度两性霉素b的制备方法，该方法通过加入助滤剂，提高发酵液滤速，通过固液分离去除杂质含量高的滤液后加入乙醇碱水溶解两性霉素b，通过膜过滤，脱色、除去热源和大分子量杂质和杂蛋白后，加入酸水得到高纯度的两性霉素b固体。

4、然而，在上述现有技术中，采用的均为高效液相色谱分析，高效液相色谱进样体积为10μl，而超高效液相相比高效液相，进样体积更少，可以降低价格昂贵的两性霉素b的消耗量，降低成本；同时，出峰时间更快，流动相消耗更少。有鉴于此，有必要对现有技术中的两性霉素b的含量分析方法予以改进，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种稳定性好、重复性好、操作简单、理论塔板数高、准确快速，用于两性霉素b的超高效液相色谱分析方法。

2、本发明所采用的技术方案是：

3、一种两性霉素b的超高效液相色谱分析方法，所述方法为：将含有两性霉素b的样品溶液进样，用超高效液相色谱柱进行检测分析，采用反向液相色谱外标百分比法定量，超高效液相色谱的条件如下：

4、色谱柱:uplc；优选为acquity uplc beh c18色谱柱，规格2.1mm*50mm，1.7μm；

5、流动相:体积比为370：630的乙腈、磷酸的混合溶液，ph为1.00±0.05；

6、检测波长：378～388nm；

7、流速：0.44～0.54ml/min；

8、柱温：20～30℃；

9、进样体积：1～5μl。

10、所述含有两性霉素b的样品溶液中，两性霉素b的浓度优选为0.01-0.2mg/ml。

11、所述含有两性霉素b的样品溶液一般为两性霉素b原料药或其制剂与稀释剂的混合。

12、所述稀释剂为体积比为50：50的二甲基甲酰胺、甲醇的混合溶液。

13、优选所述检测波长为383nm，优选流速为0.49ml/min，优选柱温25℃，优选进样体积1μl。

14、更进一步，优选所述方法按以下步骤进行：

15、将含有两性霉素b的样品溶液进样，用超高效液相色谱柱进行检测分析，采用反向液相色谱外标百分比法定量，超高效液相色谱的条件如下：

16、色谱柱：acquity uplc beh c18色谱柱，规格2.1mm*50mm，1.7μm；

17、流动相:体积比为370：630的乙腈、磷酸的混合溶液，ph为1.00±0.05；

18、检测波长为383nm，流速为0.49ml/min，柱温25℃，进样体积1μl，稀释剂为体积比为50:50的二甲基甲酰胺、甲醇的混合溶液。

19、本发明定量的方法为：

20、配制不同浓度的两性霉素b的标准溶液，进行uplc检测，将谱图中的峰面积对浓度进行线性回归，绘制标准曲线；

21、将含有两性霉素b的样品溶液按相同条件进行uplc检测，谱图的峰面积和标准曲线对比，计算得到样品溶液中两性霉素b的含量。

22、本发明的有益效果是：与现有的高效液相色谱分析方法相比，本发明提供的两性霉素b的超高效液相分析方法，进样浓度更低，可以降低价格两性霉素b的消耗量，降低成本；同时，出峰时间更快，流动相消耗更少；具有准确快速、理论塔板数高等特点，能够准确快速低成本的检测两性霉素b含量，对两性霉素b的医药研究有重要意义。

技术特征：

1.一种两性霉素b的超高效液相色谱分析方法，其特征在于所述方法为：将含有两性霉素b的样品溶液进样，用超高效液相色谱柱进行检测分析，采用反向液相色谱外标百分比法定量，超高效液相色谱的条件如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有两性霉素b的样品溶液中，两性霉素b的浓度为0.01-0.2mg/ml。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有两性霉素b的样品溶液为两性霉素b原料药或其制剂与稀释剂的混合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述稀释剂为体积比为50：50的二甲基甲酰胺、甲醇的混合溶液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述进样体积为1μl。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测波长为383nm，流速为0.49ml/min，柱温25℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述色谱柱为acquityuplc behc18色谱柱，规格2.1mm*50mm，1.7μm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：

9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于所述定量的方法为：

技术总结
本发明公开了一种两性霉素B的超高效液相色谱分析方法：将含有两性霉素B的样品溶液进样，用超高效液相色谱柱进行检测分析，采用反向液相色谱外标百分比法定量，超高效液相色谱的条件如下：色谱柱:UPLC；流动相:体积比为370：630的乙腈、磷酸的混合溶液，pH为1.00±0.05；检测波长：378～388nm；流速：0.44～0.54mL/min；柱温：20～30℃；进样体积：1～5μL。本发明提供的两性霉素B的超高效液相分析方法，与高效液相色谱法相比，进样体积更少，降低两性霉素B的消耗量，节约成本；同时，岀峰时间更快，不仅能减少流动相的消耗，同时节约检测时间；具有准确快速、理论塔板数高等特点，能够有效测岀两性霉素B含量。

技术研发人员：张聪聪,顾亚萍,王祁宁,夏浩,艾宁
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12