基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用

本发明属于细胞生物学及分子生物学领域，具体涉及一种基于fret效应的荧光对、包含其的探针及应用。

背景技术：

1、camkii是钙/钙调蛋白(ca2+/cam)依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过感知ca2+信号在细胞信号传递中发挥重要作用。除了约30个剪接变体外，还有四种camkii同工酶(a、b、c和d)在人类中表达。a和b亚型是大脑特有的，c和d亚型在大多数组织中都有表达，在心脏组织表达更多。有研究表明，camkii在学习记忆、突触形成、心血管疾病等均发挥重要作用，因此研究活细胞中camkii活性的精准时空调控有重要意义。目前常采用基于fret原理的camui作为传感器探测活细胞内camkii活性，传统camui采用经典荧光蛋白对，包括青色荧光蛋白/黄色荧光蛋白(cfp/yfp)作为荧光对。。

2、传统camui设计缺点有：cfp与yfp的荧光量子产率不高且两者的ph敏感性较高；cfp有强烈的荧光开关现象，影响fret比率；常用氯化钙为钙离子来源时，yfp对氯离子(cl-)敏感，会被氯离子(cl-)猝灭。以上缺陷造成cfp/yfp无法用于活细胞中camkii活性的精准时空调控研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种cerulean3/venus作为荧光对，取代cfp/yfp，并设计新的camui代替传统camui。venus作为yfp的变体，折叠良好，对酸性环境和氯离子暴露相对耐受，采用氯化钙试剂检测活细胞时可以减少氯离子对荧光的影响。cerulean3作为cfp的变体为更加明亮，具有单一荧光指数的蛋白，相比于cfp，cerulea3的荧光量子产率更高，且荧光开关行为显著降低，光更稳定。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种基于fret效应的荧光对,所述荧光对为cerulean3与venus。

4、一种包含上述荧光对的探针，它的结构为mvenus-camkiiδ-mcerulean3,见图1。本发明camui结构，与传统camui结构相比，将cfp替换为mvenus，将yfp替换为mcerulean3。camui结构是mcerulean3连接于camkiiδ的c端,mvenus连接于camkiiδ的n端，其氨基酸序列如seqid no.1所示。

5、一种所述探针的应用，所述探针用于检测活细胞内camkii的活性。检测机理如图2所示：钙离子/钙调蛋白(ca2+/cam)结合在camkii的调节区域(regulatory)，激酶区域（catalytic）与调节区域分开从而camkii构象改变，增加mcerulean与mvenus的距离，使得两荧光蛋白间的fret降低。

6、一种所述探针的制备方法，该方法为行业内成熟的基因重组方法，具体为以人camkiiδ基因为目的基因，在其cds前后添加酶切位点，然后重组在mcerulean3（seqidno.2）与mvenus（seqid no.3）两种荧光蛋白基因序列之间，从而产生mvenus-camkiiδ-mcerulean3的融合体，融合体的核苷酸序列如seqid no.4所示。将融合体序列片段克隆在质粒载体上形成重组质粒，将重组质粒转入感受态细菌进行克隆复制，对得到的质粒提纯并对该融合基因进行测序和序列分析；将提纯后的质粒转染宿主细胞表达得到所述探针。

7、作为技术方案的进一步改进，所述质粒载体为pcmv-blank载体。

8、本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明的荧光对相比于原有的经典蛋白对cfp/yfp，荧光量子产率高且两者的ph敏感性低，fret比率稳定，对氯离子(cl-)敏感性降低。进一步说，本发明的探针可用于活细胞中camkii活性的精准时空调控检测和研究。再一步说，本发明的探针采用常规的基因重组方法制备，操作简单，价格低廉。

技术特征：

1.基于fret效应的荧光对,其特征在于，所述荧光对为cerulean3与venus。

2.一种包含权利要求1所述荧光对的探针，其特征在于，它的结构为venus-camkii-cerulean3,cerulean3连接于camkii的c端,venus连接于camkii的n端，其氨基酸序列如seqid no .1所示。

3.一种根据权利要求2所述探针的应用，其特征在于，所述探针用于检测活细胞内camkii的活性。

4.一种根据权利要求2所述探针的制备方法，其特征在于，以人camkiiδ基因为目的基因，将其克隆在mcerulean3与mvenus两种荧光蛋白基因之间，从而产生mvenus-camkiiδ-mcerulean3的融合体；将构建物克隆在质粒载体上形成重组质粒；将重组质粒转入感受态细菌进行克隆复制，对得到的质粒提纯并对该融合基因进行测序和序列分析；将提纯后的制粒转染宿主细胞表达得到所述探针。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制粒载体为pcmv-blank载体。

技术总结
本发明提供一种基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用,所述荧光对为Cerulean3与Venus，本发明还提供一种包含所述荧光对的探针，所述探针可用于检测活细胞内CaMKII的活性，研究活细胞中CaMKII活性的精确时空调控。

技术研发人员：郑秋凌,郝海平,吕志文,郑啸
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12