一株可同时产香叶醇、芳樟醇的铅黄肠球菌的制作方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一株可同时产香叶醇、芳樟醇的铅黄肠球菌。

背景技术：

1、芳樟醇(linalool)是天然存在于植物中的具有特殊香味的非环状单萜烯醇，是一种应用范围较广的化学物质。芳樟醇微溶于水，易溶于有机溶剂，易挥发。芳樟醇具有铃兰香气，但随来源不同而有不同香气，因此芳樟醇在食品、香化、医药、日化等领域均具有重要应用价值。芳樟醇因其香气成为香水、家用清洁护理产品中高频使用的香料，芳樟醇也会作为食用香精应用于食品工业。芳樟醇还是工业生产中的重要中间体。现有研究证明，芳樟醇具有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药理活性，药用前景广阔。

2、香叶醇(geraniol)属含氧单萜。香叶醇同样因其香味而广泛应用于各个行业。香叶醇具有玫瑰香并略带甜气息。香叶醇广泛应用于食品和化妆品工业中。同样的，香叶醇也可以添加剂的形式应用于先进燃料、药物以及杀菌剂中。

3、现有技术中，芳樟醇及香叶醇的合成主要是采用植物提取和化学合成。公开号为cn102397788a的中国专利公开了一种脱氢芳樟醇选择性加氢制芳樟醇的方法，包括脱氢芳樟醇与溶剂混合后于氢气中以液相通过固定床催化剂床层进行加氢反应，溶剂为c2～c4脂肪醇，溶剂比为1：(0.5～1.2)，液时空速为2.0～2.5hr-1。化学合成方法通常比较昂贵，且会产生大量的废气废液废渣。

4、公开号为cn101619013的中国专利公开了一种从芳樟树叶中蒸馏提取天然芳樟醇的方法，首选是通过选取芳樟优良单株，得到高品质的芳樟母株，其鲜叶蒸馏提油得油率不低于1.5％，叶油中芳樟醇含量不小于97％，樟脑含量不大于0.2％，桉叶油素含量不大于0.2％，将选育出的母株繁殖，从樟树叶中蒸馏提取芳樟醇。在获取优良母株的基础上进行纯种单株的无性繁殖：如组织培养、扦插等方法育苗。从天然芳香植物中提取单萜因产量和提取效率较低、易受各种自然因素影响，导致大部分单萜类化合物的价格居高不下。

5、基于此，微生物细胞合成单萜的方法因其原料来源广泛、不受空间和环境的限制、成本低、产物单一且生产周期短而成为替代植物提取和化学合成的热点研究方向。

6、现有研究中可利用酿酒酵母或大肠杆菌构建工程菌株表达芳樟醇合成酶基因，达到微生物法合成芳樟醇的目的。公开号为cn111411101b的中国专利公开了一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：e352h或e343d。然而，基于酿酒过程中对多种醇类物质的生产需求，现有技术中为获得符合品质要求的酒会向发酵混合物中添加多种工程菌株，然而，工程菌株的数量和种类的增多意味着发酵条件要求的提高，且增加了不同菌类生长竞争的风险。目前，尚未得知铅黄肠球菌具有同时产香叶醇和芳樟醇的能力。本发明提供一株可同时产香叶醇、芳樟醇的铅黄肠球菌，其能够在生长过程中同时产香叶醇、芳樟醇。

7、此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

1、针对现有技术之不足，本发明提供了一种铅黄肠球菌。本发明提供的铅黄肠球菌已于2022年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmcc no.25150，名称为：铅黄肠球菌zqw97(enterococcus casseliflavus)。

2、本发明提供的菌株能够同时生产提高酒类风味的香叶醇和芳樟醇，且其在对自然环境不产生污染的情况下优化了发酵培养基，使白酒在生产过程提高了其风味丰富度。

3、本发明提供的菌株筛选自自然界。采用两相发酵工艺，该菌株所产香叶醇含量为9.77mg/l，芳樟醇含量为3.06mg/l。在不低于两类菌株分别生产香叶醇和芳樟醇的含量的情况下，本发明提供的菌株既能够同时生产两种风味物质，又能够多代稳定表达。

4、根据一种优选实施方式，所述菌株能够自酒精发酵物中分离获得。优选地，本发明中的酒精发酵物能够为参与酒精酿造的物质。例如，窖泥、糟醅、填料、添加剂、酒曲以及其他包含微生物成分的且参与酿酒过程的物质。

5、本发明提供一种所述铅黄肠球菌的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

6、窖泥样品于mrs固体培养基平板培养，获得不同菌落形态的单菌落；

7、于mrs固体培养基中二次接种不同菌落形态的单菌落，以获得纯化的所述铅黄肠球菌。

8、多代培育获得纯化后的菌株。通过该纯化方法，确定了本发明提供的菌株能够多代稳定遗传。

9、对所述铅黄肠球菌进行分子生物学鉴定，其16s rdna序列如表1示出的seq idno.1。

10、本发明提供一种所述菌株于同时产香叶醇、芳樟醇中的用途。

11、根据一种优选实施方式，所述铅黄肠球菌能够在包含乙醇的培养环境中生产香叶醇和芳樟醇。

12、本发明提供一种培养基，其能够培养所述菌株。

13、本发明还涉及分别包含本发明的菌株、无微生物提取物以及包含其他芳香醇类物质的组合物。本发明还涉及基于本发明提供的菌株所对应的生产的香叶醇、芳樟醇的方法，其包括分别使用有效量的本发明的菌株、该菌株栖息地、该菌株繁殖材料、无微生物提取物、培养基以及包含其他芳香醇类物质的组合物。

14、根据一种优选实施方式，所述培养基包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、吐温80、柠檬酸三铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锰和磷酸氢二钾。优选地，本发明中涉及的菌株能够于mrs液体或固体培养基中生长繁殖。

15、芳樟醇具有带甜的木青气息，似玫瑰木香气，更似刚出炉的绿茶青香，既有紫丁香、铃兰香与玫瑰的花香，又有木香、果香气息。香气柔和，轻扬透发，不甚持久。左旋结构的芳樟醇偏甜润，右旋结构的芳樟醇偏清青。香叶醇作为香气辅料，参与构成柑橘花香、天竺葵香等多种花香。在酒类的风味上来讲，芳樟醇和香叶醇能够增加白酒风味的丰富度。香气与人体的健康和机能存在重要的关系。比如芳樟醇等能让人们身体产生舒适感。美国医生斯登福特和心理学家-雷诺尔茨对5000人测试，证明常闻花香，对情绪和健康都能产生很好的影响。人们对于白酒的香气如此着迷，也与其中的香气物质作用于感官系统，进而让机体和心态产生舒适感有一定关系。

16、白酒的品质受白酒酿造过程中的窖泥的品质决定。现有技术中，窖泥的微生物组分复杂且不透明，使得每一期的白酒酿造都需要基于人工的手感调整，而无法获得统一的口感。对于具有优秀口感的白酒而言，由于糟醅、窖泥复杂的微生物构成而无法探究其生产的影响因素。本发明提供的一种铅黄肠球菌，其筛选于浓香型优质老窖泥。通过在窖泥中分离、纯化和验证其中的微生物组分，能够为探究窖泥对酿酒的贡献以及对酒类品质的影响提供线索。基于此，本发明提供一种酒，其至少包含由所述菌株生产的香叶醇和芳樟醇。已知芳樟醇和香叶醇是酒类中重要的提香物质，因此，基于微生物发酵的酒类中包含能够同时生产香叶醇和芳樟醇的菌株对于发酵过程中的酒的品质提升具有重要作用。本发明提供的菌株提取自窖泥中，其同样验证了本发明提供的菌株能够在具有乙醇的环境中生长和繁殖，并生产香叶醇和芳樟醇。

17、本发明提供一种包含所述菌株的组合物。本发明的菌株能够以组合物的形式应用于需要以香叶醇或芳樟醇作为成分的物质中。

18、根据一种优选实施方式，本发明提供的菌株能够与其他菌株构成组合物而应用于食用酒的制备。食用酒中存在的有益菌株包含曲霉、根霉、放线菌、耐高温芽抱杆菌、酵母和细菌。具体地，细菌包含乳酸菌、已酸菌、醋酸菌、丁酸菌、甲烷菌、丙酸菌、丁酸菌。乳酸菌包含乳酸球菌、乳酸杆菌。酵母包含酿酒酵母和产酯酵母。本发明提供的菌株能够与上述涉及的菌株中的一种或多种构成组合物。组合物能够在酒精发酵过程中发挥作用。

19、优选地，本发明提供的组合物包含：

20、铅黄肠球菌，黑曲霉，根霉菌，酿酒酵母；

21、铅黄肠球菌，红曲霉，根霉菌，酿酒酵母；

22、铅黄肠球菌，黑曲霉，红曲霉，黑根霉菌，酿酒酵母；

23、铅黄肠球菌，黑曲霉，红曲霉，黑根霉菌，酿酒酵母，已酸菌；

24、铅黄肠球菌，黑曲霉，红曲霉，黑根霉菌，产酯酵母，已酸菌。

25、铅黄肠球菌，乳酸球菌，黑曲霉，红曲霉，黑根霉菌，酿酒酵母；

26、铅黄肠球菌，乳酸杆菌，黑曲霉，黑根霉菌，酿酒酵母，已酸菌，醋酸菌，丁酸菌，甲烷菌，丙酸菌。

27、本发明提供一种铅黄肠球菌于食品、药品、抑菌剂中的应用。对于食品领域，香叶醇或芳樟醇被广泛应用。具体地，芳樟醇对于伯爵茶来说是一个关键的成分，添加到茶叶或粉末的量高达0.3％，由本发明提供的生产芳樟醇的菌株能够应用于茶物质的生产中。香叶醇或芳樟醇是调香中的重要香精原料，本发明提供的生产芳樟醇和香叶醇的菌株能够用于香精提纯领域中。

28、基于上述产品需求，在工业化生产中，使用本发明提供的菌株生产香叶醇和芳樟醇，并通过分离纯化的手段获得香叶醇和芳樟醇。