醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其应用

(一)本发明涉及一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其改造，并使用改造后的共表达重组菌不对称还原6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化合成阿托伐他汀钙双手性侧链6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、心血管疾病是当今对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过肿瘤性疾病而跃居第一。血液低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平上升是诱发心血管疾病的一个重要因素，3-羟基-3-甲基辅酶a(hmg-coa)还原酶是胆固醇合成的关键限速酶。阿托伐他汀钙能竞争性抑制胆固醇合成的关键限速酶—hmg-coa还原酶活性，减少胆固醇的合成，控制体内ldl-c浓度，是临床上广泛使用的降血脂药。阿托伐他汀是全合成他汀类药物，具有毒性低、降脂能力强、起效快、安全性高和作用时间长等特点。“立普妥”(辉瑞阿托伐他汀钙的商品名)是第一种在美国年销售额达到100亿美元的药物，是全球最畅销的制药产品。

2、阿托伐他汀具有(3r,5r)-二羟基己酸酯侧链，两个手性中心是其重要的药效基团，导致合成高纯度的该侧链中间体6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯十分具有挑战性。各国药监部门对手性药物的光学纯度设置了严苛的限制(ee值>99.5％，de值>99％)。以6-氰基-(5r)-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯为底物合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯可分为化学法和生物酶法。传统化学法合成常采用以硼烷等为催化剂、深冷条件下反应，不仅合成条件苛刻、反应能耗大且产物手性纯度低。生物酶法合成有反应条件温和、产物光学纯度高、环境污染低等优点，符合绿色合成的发展要求，具有重大的研究意义。

3、本实验室前期通过半理性设计、定向进化等手段，筛选获得一株具有良好催化6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的菌株(已专利申请cn201710282633.x，cn201910072740.9，cn201910932502.0，cn202110136118.7，cn202110900178.1)。利用醛酮还原酶不对称还原6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯往往需要偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是针对醛酮还原酶参与催化反应时需要额外添加葡萄糖脱氢酶构建辅酶再生系统，这无疑增加了生产成本的问题，提供一种活性高、立体选择性好的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其在不对称还原6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，通过改变醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因相关的启动子、rbs、基因序列等在表达载体上的基因元件，并通过诱导调控表达系统来调节醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶的表达水平，克服催化剂制备与用量成本问题，实现胞内辅酶高效再生，提高反应效率，应用于生物催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基-己酸叔丁酯。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌，所述重组菌是将seqid no：1所示醛酮还原酶基因和seq id no：2所示葡萄糖脱氢酶基因共同转入表达载体，构建共表达重组质粒，再将共表达重组质粒转化宿主菌，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌。所述醛酮还原酶来自乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis,genbank:mn206979.1)，葡萄糖脱氢酶来自巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium,genbank:lk055286.1)。

4、优选的，所述共表达重组质粒的构建是将醛酮还原酶基因插入载体ndei与xhoi酶切位点之间；葡萄糖脱氢酶基因插入载体ncoi与noti酶切位点之间。

5、优选的，醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用t7启动子和阿拉伯糖pbad启动子表达；所述t7启动子核酸序列为seq id no：6所示；所述pbad启动子核酸序列为seqid no：7所示。

6、seq id no：6

7、taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacat.

8、seq id no：7

9、ttatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgtttttttgggctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat.

10、优选的，所述醛酮还原酶基因为seq id no：5所示醛酮还原酶突变体编码基因，且醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用t7启动子和阿拉伯糖pbad启动子表达。

11、本发明所述的重组质粒可以通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可以为本领域常规的各种载体，如pacycduet、pcdfduet、petduet、prsfduet、pcoladuet、pgex、pmal、pet-28a、pet-28b等，优选pcdfduet、petduet或prsfduet，更优选将pcdfduet中t7启动子替换为pbad启动子改造后的载体。

12、优选，所述共表达重组质粒按如下方法构建：将seq id no：1所示醛酮还原酶基因kmakr(记为kmakrm8)插入质粒pet-28a(+)的多克隆位点ndei与xhoi酶切位点之间，获得质粒pet-28a(+)-kmakrm8；以pet-28a(+)-kmakrm8为模板扩增seq id no:1所示kmakr基因插入片段；将seq id no：2所示葡萄糖脱氢酶基因(记为bmgdhm0)插入质粒pcdfduet的多克隆位点(msc1)中ncoi与noti酶切位点之间，构建重组质粒pcdfduet-bmgdhm0；以pcdfduet-bmgdhm0为模板扩增带有同源臂和葡萄糖脱氢酶基因的线性化载体片段；将kmakr基因插入片段与线性化载体片段通过一步克隆试剂盒进行连接，进而获得含有醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因的共表达重组质粒。

13、本发明一方面通过基因突变来增加全细胞催化活性，具体为下列方法中的一种：(1)通过优化葡萄糖脱氢酶基因的核酸序列(不改变氨基酸序列)来调节葡萄糖脱氢酶的表达水平，将seq id no：2所示葡萄糖脱氢酶基因突变为seq id no：3所示；(2)在seq id no：3所示核苷酸序列前端起始密码后的6个氨基酸密码子(met-tyr-lys-asp-leu-glu-gly)进行优化，优化后葡萄糖脱氢酶基因序列seq id no：4所示；(3)对seq id no：1所示的醛酮还原酶基因(记为kmakrm8)进行定点突变得到seq id no：5所示的醛酮还原酶基因kmakrm8-n109k/s196c/s232a/s182h/q266d(记为kmakrm13)。

14、本发明另一方面通过优化葡萄糖脱氢酶和醛酮还原酶的启动子，以及诱导调控表达系统来调节酶的表达水平。所述的启动子可以为本领域常规的各种启动子，如t7启动子、tac启动子、trc启动子、阿拉伯糖启动子和鼠李糖启动子。优选用t7启动子启动醛酮还原酶的基因表达，用阿拉伯糖启动子pbad启动葡萄糖脱氢酶的基因表达。

15、优选的，本发明醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用t7启动子和阿拉伯糖pbad启动子表达的共表达重组质粒，以seq id no：1所示醛酮还原酶基因和seq id no：4所示葡萄糖脱氢酶突变基因为例，具体按如下方法构建：所述重组质粒pcdfduet-pbad-(codon5)bmgdhm4-kmakrm8为单质粒，所述重组质粒按如下步骤构建：(1)以含seq id no：4所示葡萄糖脱氢酶基因的pglo-(codon5)bmgdhm4为模板，通过上游引物：5’-ttatgacaacttgacggctacatcatt-3’，下游引物5’-gagtttgtagaaacgcaaaaaggc-3’，进行pcr扩增获得具有seq id no：4所示葡萄糖脱氢酶基因和seq id no：7所示的pbad启动子的插入片段pbad-bmgdhm4；(2)以重组共表达载体pcdfduet-(codon5)bmgdhm4-kmakrm8为模板，通过上游引物：5’-ttttgcgtttctacaaactcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtaca-3’，下游引物5’-tagccgtcaagttgtcataaatttcctaatgcaggagtcgc-3’，进行pcr扩增获得含seq id no：6所示t7启动子且具有同源臂的线性化质粒；(3)将步骤(1)获得的含葡萄糖脱氢酶基因和pbad启动子的插入片段与步骤(2)获得的含t7启动子且具有同源臂的线性化质粒，通过一步克隆试剂盒进行连接，进而获得含有本发明的醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶分别由t7启动子和pbad启动子分开诱导表达的重组共表达载体pcdfduet-pbad-(codon5)bmgdhm4-kmakrm8。

16、本发明所述的宿主菌可为本领域常规的各种宿主微生物，优选e.coli bl21(de3)。将本发明前述的重组载体通过常规转化方法转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，即可得本发明所述的重组菌。

17、本发明还提供一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌在催化6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，具体所述的应用为：以所述共表达重组菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，和/或添加nadp+(和/或是指nadp+可以添加，也可以不添加)，以ph6.0-8.5缓冲溶液为反应介质构成转化体系，在25-45℃、400-800rpm进行转化反应，用6m碳酸钾水溶液中和转化反应产生的葡萄糖酸维持ph值，反应结束后，获得含有6-氰基-(3r,5r)-二羟基-己酸叔丁酯的转化液，转化液分离纯化后，获得6-氰基-(3r,5r)-二羟基-己酸叔丁酯。

18、进一步，所述底物加入终浓度以缓冲液体积计为200g/l-600g/l(优选300g/l)；辅底物葡萄糖初始加入浓度以缓冲液体积计为200g/l-600g/l(优选300g/l)，催化剂用量以湿菌体干重(dcw)计为1g dcw/l-10g dcw/l(优选4.5g dcw/l)；nadp+添加量为0-0.1mm(0代表不添加)，优选0.1mm。

19、进一步，优选反应介质为100mm、ph 7.0磷酸钾缓冲液；优选在35℃、600-800rpm条件下进行转化反应。

20、进一步，所述催化剂按如下方法制备：将共表达重组菌接种到含有终浓度50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度0.5％-3.0％(优选2.0％)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(od600＝0.6-0.8)，培养液中加入终浓度为0.05mm-0.30mm(优选0.15mm)异丙基硫代半乳糖苷(iptg)和终浓度为0.2mm-1mm(优选0.8mm)阿拉伯糖，20℃-30℃(优选28℃)培养8h-16h(优选14h)后，4℃、8000rpm离心10min，获得所述的湿菌体。

21、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明通过构建醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌克服现有方法偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系的缺陷。本发明通过突变醛酮还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的编辑基因、替换葡萄糖脱氢酶的启动子为启动子pbad的方法，结合调整诱导剂浓度便捷地调节胞内双酶活性，最大程度地提高底物投加浓度和底物转化率，同时提高产物dep值。本发明方法构建的菌株e.coli bl21(de3)/pcdfduet-pbad-(codon5)bmgdhm4-kmakrm13，最大底物投料量可达300g/l，底物转化率大于99％，产物dep值始终保持在99.5％以上。本发明方法构建的共表达重组菌株能克服催化剂制备与用量成本问题，同时双酶共表达体系有利于全细胞固定化，更具工业化应用前景。