一种在大肠杆菌中表达生产TerrequinoneA的基因组合及其应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达生产terrequinone a的基因组合及其应用。

背景技术：

1、双吲哚醌类化合物是一类具有抗逆转录病毒、抗糖尿病或细胞毒性生物活性的真菌天然产物。双吲哚醌自可皆霉素(cochliodinol)被发现以来，其家族成员不断壮大，而在这其中，从沙漠植物根际真菌土曲霉(aspergillus terreus)中首次分离出来的terrequinone a，对四种人类癌细胞(ncih460、mcf-7、sf-268和mia pa ca-2)具有中等细胞毒性，是一种潜在的抗癌药物(he et al.,journal of natural products,2004,67(12):1985-1991)，也是唯一一种有生物合成信息的双吲哚醌类化合物。2004年，bok等人利用转录调控因子laea对构巢曲霉(aspergillus nidulans)的次生代谢组进行了挖掘，识别了terrequinone a的合成基因簇tdiabcde(bok et al.,eukaryotic cell,2004,3(2):527-535)。

2、terrequinone a作为一种天然产物，其结构复杂、官能团较多，采用化学合成法所需步骤多、产率低以及环境不友好，随着terrequinone a在生物体内进行合成和修饰的特殊途径被阐明，利用生物催化法合成terrequinone a成为一种有效的尝试，balibar等人分别过表达和研究了tdiabcde基因簇中的5个基因，通过酶的体外分步反应成功合成了terrequinone a(carl j balibar等人,terrequinone a biosynthesis through l-tryptophan oxidation,dimerization and bisprenylation,nature chemical biology,2007,3(9):584-592)。然而，体外合成需要外源性地添加昂贵的辅因子和辅因子再生酶系；另外，游离酶催化体系中一种酶催化的产物往往是下一个酶的底物，其底物产物的传递通常受到空间的限制，降低了产物的合成效率。因此，需要寻求更加高效的方法来生产terrequinone a。大肠杆菌作为一种优良的生物反应器，通过对其进行合成途径的改造或引入新的代谢途径，可用于生物合成高价值天然产物，它能完美地规避上述两个问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中表达生产terrequinone a的基因组合及其应用，从而解决现有技术中体外合成terrequinone a存在的生产成本较高、合成效率较低的问题。

2、为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供一种在大肠杆菌中表达生产terrequinone a的基因组合，所述基因组合包括tdias基因、tdibs基因、tdics基因、tdids基因、tides基因、sfps基因、sccks基因和atipks基因，其中，所述tdias基因、tdibs基因、tdics基因、tdids基因、tides基因、sfps基因、sccks基因和atipks基因的核苷酸序列如seq id no.1～8所示。

4、根据本发明的第二方面，提供一种用于生产terrequinone a的重组质粒pc02，所述重组质粒pc02由基因表达盒t7 tdias、t7 tdibs、t7 tdics、t7 tdids、t7 tides、t7sfps按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒t7 tdias、t7 tdibs、t7 tdics、t7 tdids、t7 tides、t7 sfps由核苷酸序列如seq id no.1～6所示的tdias基因、tdibs基因、tdics基因、tdids基因、tides基因、sfps基因分别与t7启动子和终止子连接而成。

5、优选地，所述大肠杆菌表达载体为pcambia1301。

6、根据本发明的第三方面，提供一种用于生产terrequinone a合成所需原料二甲基烯丙基焦磷酸dmapp的重组质粒pu03，所述重组质粒pu03由基因表达盒t7 sccks和t7atipks按顺序串联并连接到大肠杆菌表达载体上构建而成，其中，所述基因表达盒t7sccks和t7 atipks由核苷酸序列如seq id no.7～8所示的sccks基因和atipks基因分别与t7启动子和终止子连接而成。

7、优选地，所述大肠杆菌表达载体为puc19。

8、根据本发明的第四方面，提供一种可生产terrequinone a的重组大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：s1：对tdia基因、tdib基因、tdic基因、tdid基因、tide基因、sfp基因、scck基因和atipk基因按大肠杆菌表达模式优化，分别获得tdias基因、tdibs基因、tdics基因、tdids基因、tides基因、sfps基因、sccks基因和atipks基因，所述tdias基因、tdibs基因、tdics基因、tdids基因、tides基因、sfps基因、sccks基因和atipks基因的核苷酸序列如seq id no.1～8所示，将八个基因分别与t7启动子和终止子连接，构建基因表达盒t7tdias、t7 tdibs、t7tdics、t7 tdids、t7 tides、t7 sfps、t7 sccks和t7 atipks；s2：将步骤s1获得的六个基因表达盒t7 tdias、t7 tdibs、t7 tdics、t7 tdids、t7 tides和t7 sfps连接入大肠杆菌表达载体，获得含tdias、tdibs、tdics、tdids、tides和sfps的六个基因表达盒的重组质粒pc02；s3：将步骤s1获得的两个基因表达盒t7 sccks和t7 atipks连接入大肠杆菌表达载体，获得含sccks和atipks的两个基因表达盒的重组质粒pu03；s4：将步骤s2获得的重组质粒pc02和步骤s3获得的重组质粒pu03同时转化到大肠杆菌中，获得可生产terrequinone a的重组大肠杆菌。

9、步骤s2中，将六个基因表达盒t7 tdias、t7 tdibs、t7 tdics、t7tdids、t7 tides和t7 sfps按顺序串联，并在t7 tdias的5’-端连接ecorⅰ内切酶位点，在t7 sfps的3’-端连接hindⅲ内切酶位点，获得ecorⅰ-t7tdias-t7 tdibs-t7 tdics-t7 tdids-t7 tides-t7sfps-hindⅲ。

10、步骤s3中，将两个基因表达盒t7 sccks和t7 atipks按顺序串联，并在t7 sccks的5’-端连接ecorⅰ内切酶位点，在t7 atipks的3’-端连接hindⅲ内切酶位点，获得ecorⅰ-t7sccks-t7 atipks-hindⅲ。

11、根据本发明的第五方面，提供一种根据上述方法获得的可生产terrequinone a的重组大肠杆菌。

12、根据本发明的第六方面，提供一种利用重组大肠杆菌生产terrequinone a的方法，将所述重组大肠杆菌接种于含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的m9液体培养基中，37℃培养至菌液od600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养14～18h，向发酵液中添加底物l-色氨酸和异戊烯醇，然后在30℃培养22～26h，即可生产terrequinone a；其中，每升所述m9液体培养基包括：15g甘油，6g na2hpo4，3g kh2po4，1g nh4cl，0.5g nacl，0.12g mgso4，0.011g cacl2，2.9mg znso4·7h2o，0.2ml 1％(w/v)维生素b1，5g水解酪蛋白。

13、根据本发明的一个优选方案，将重组大肠杆菌bl-3接种于含100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的优化后的m9液体培养基(15g甘油(glycerol)，6g na2hpo4，3g kh2po4，1g nh4cl，0.5g nacl，0.12g mgso4，0.011g cacl2，2.9mg znso4·7h2o，0.2ml 1％(w/v)维生素b1(vitamin b1)以及5g水解酪蛋白(acid-hydrolyzed casein)每升)中，37℃培养至菌液od600达到0.6时，加入0.2％阿拉伯糖，继续在25℃培养16h，向发酵液中添加底物l-色氨酸和异戊烯醇，然后在30℃培养24h，即可生产terrequinone a。

14、优选地，向发酵液中添加底物l-色氨酸的浓度为0.75g/l，异戊烯醇的浓度为0.95g/l。

15、本发明中，根据大肠杆菌的密码子偏好性对tdia基因、tdib基因、tdic基因、tdid基因、tide基因、sfp基因、scck基因和atipk基因作为整体进行优化，优化原则包括：(一)按照大肠杆菌密码子偏爱性优化基因，优化基因密码子，提高基因翻译效率；(二)消除茎环结构、转录终止信号、同一基因或相邻基因200bp以内的逆向重复序列，并使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；(三)使基因编码蛋白符合n端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(四)优化mrna二级结构自由能，以提高基因表达效率；(五)在满足上述四个原则的基础上，选择消除四个基因内部的ecori和hindiii内切酶识别位点，便于构建重组质粒；优化后获得tdias、tdibs、tdics、tdids、tides、sfps、sccks和atipks基因。

16、本发明通过化学方法合成了编码非核糖体肽合成酶的tdias基因、编码甲代丙烯基-l-色氨酸合成酶的tdibs基因、编码氧化还原酶的tdics基因、编码氨基转移酶的tdids基因、编码伴侣蛋白的tides基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfps基因、编码胆碱激酶的sccks基因和编码异戊烯基磷酸激酶的atipks基因，首次将该八段基因分别与大肠杆菌t7启动子和终止子连接，构建成相应的基因表达盒。将六个基因表达盒t7 tdias、t7tdibs、t7 tdics、t7 tdids、t7 tides和t7 sfps连接入大肠杆菌表达载体，获得重组质粒pc02；将两个基因表达盒t7 sccks和t7 atipks连接入大肠杆菌表达载体，获得重组质粒pu03；将pc02和pu03同时转化到大肠杆菌中，获得的重组工程菌可用于生产具有抗癌细胞生物活性的terrequinone a，在添加0.75g/l的l-色氨酸和0.95g/l的异戊烯醇的情况下，其发酵液中terrequinone a的含量可达到106.3mg/l。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

18、本发明利用合成生物学技术，对tdia基因、tdib基因、tdic基因、tdid基因、tide基因、sfp基因、scck基因和atipk基因按大肠杆菌表达模式优化，优化后分别与大肠杆菌t7启动子和终止子连接，构建基因表达盒，再与大肠杆菌表达载体连接获得多基因大肠杆菌转化载体，构建基因工程菌，编码非核糖体肽合成酶的tdias基因、编码甲代丙烯基-l-色氨酸合成酶的tdibs基因、编码氧化还原酶的tdics基因、编码氨基转移酶的tdids基因、编码伴侣蛋白的tides基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfps基因、编码胆碱激酶的sccks基因和编码异戊烯基磷酸激酶的atipks基因均能活性表达，以l-色氨酸和异戊烯醇为底物，可生产具有抗癌细胞生物活性的terrequinone a，在生物制药领域具有潜在的应用价值。

19、在构巢曲霉(aspergillus nidulans)的terrequinone a合成途径中，每一分子terrequione a的合成需要消耗2分子的dmapp，大肠杆菌中原有的mep途径所产生的dmapp无法满足terrequione a合成的需求，本发明在大肠杆菌中同时转入了多基因转化载体pu03，获得的重组菌以异戊烯醇为底物，可为terrequinone a合成提供充足的dmapp。

20、he等人对土曲霉(aspergillus terreus)经过28天的培养后，从5.4l的发酵液中分离得到6.0mg terrequinone a粉末(he et al.,journal of natural products,2004,67(12):1985-1991)。与天然菌株aspergillus terreus相比，本发明的重组大肠杆菌在经过48h的培养后，发酵液中terrequinone a的含量可达到106.3mg/l，在转化速率和产物浓度上均有显著提高。