质谱技术在鉴定肌肉生物标志物的用途

本技术涉及检测和生物标志物领域，具体涉及质谱技术在鉴定肌肉纤维亚型及相关疾病的生物标志物中的应用。

背景技术：

1、基质辅助激光解吸/电离质谱成像(maldi-msi)通过对组织切片分解成若干个像素点并对每个像素点进行激光电离后获得数千个分子的空间分布图，是将质谱的分子敏感性和特异性与空间分辨能力相结合的强大工具。已有研究表明一些质谱成像仪器在一定的条件下达到单细胞分辨率(1-4)，但需要通过升华或组织化学衍生化来优化基质分子晶体。虽然升华可以实现纳米级基质晶体，但它在电离效率和分子灵敏度上付出了巨大代价，因此只能对几种目标代谢产物进行分析，无法进行代谢组学分析。而组织化学衍生化虽然可以增强分子电离效率并提高横向空间分辨率，但它也局限于预定义的标记化合物的测量(5-7)，同样不能用于代谢组学分析。此外，较低空间分辨率的质谱成像工作流程已经被开发出来用于辅助传统组织学分型，即通过增加代谢标记物的空间分布分析疾病状态，为临床治疗提供参考(8,9)。如今数字图像分析领域已经迅速发展，可以使用机器学习算法对质谱成像进行评估和注释，但图像配准不精确阻碍了质谱成像代谢组学的应用(10,11)。此外，由于msi中没有色谱图，因此没有保留时间等信息辅助代谢物的分离、鉴定和准确注释。因此，获得准确注释、图像精确配准及高分辨率质谱图像等使msi代谢组学分析仍具有挑战性。

2、骨骼肌提供了一个独特的机会来驱动msi的技术创新，因为它的结构相对简单，易于成像分析，更重要的是单肌纤维细胞的大小足以提供超过检测离子极限的代谢物以及肌纤维之间的代谢异质性为代谢组学分析提供了丰富的信息。单肌纤维细胞实际上是具有细长结构的单个多核细胞，是msi进行高空间分辨率分析的理想模型。

3、肌肉纤维可大致分为慢肌纤维和快肌纤维。根据肌球蛋白atp酶表达和氧化代谢的差异，快肌纤维进一步分为三个主要亚型：2a、2x和2b。这些肌纤维亚型具有不同的功能和代谢特性。慢肌纤维(1型)收缩速度慢、持续时间长、线粒体氧化酶表达更高且抗疲劳，而快肌纤维(2型)更多依赖糖酵解酶快速产生的能量，以进行快速爆发的阻力运动，其中2b型是氧化能力最低，2a型氧化能力是快肌纤维中最高的，每种亚型都拥有自己独特的肌球蛋白重链亚型(12)。

4、肌纤维的代谢组学分析将提高我们对所有肌纤维亚型及其与运动能力、行动、肌肉衰减综合症(13,14)、恶病质、肌肉萎缩和肌肉相关代谢疾病(15,16)相关的分子机理的认识。肌肉纤维在内在或外在因素的刺激下会改变肌纤维命运，由快肌纤维转变为快肌纤维，反之亦然(17-19)。因此肌肉纤维作为有丝分裂后细胞命运转变的模型了解其代谢的动态状态有助于理解生理和病理条件下肌纤维重塑的机制。然而，我们的理解受到基本生化技术的限制，例如快速/慢速肌球蛋白atp酶免疫染色，或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)四氮唑还原酶、琥珀酸脱氢酶(sdh)和细胞色素c氧化酶的酶组织化学，是非定量、低维度的技术，且一次只能分析少数几种酶。此外，有研究试图通过体外外分离单个肌纤维来研究慢肌纤维和快肌纤维代谢分析(20-23)，但仍有许多技术障碍需要克服。目前仍没有人对在体肌纤维进行代谢组学分析。

5、考虑到这些挑战，我们从冷冻切片到msi代谢组学的数据分析等方面优化了maldi-msi技术流程，并对在体肌纤维进行了代谢组学分析，成功地表征了不同肌纤维亚型的代谢组学特征，发现了一种新的肌纤维亚类型。该技术流程可以成为代谢组学应用的新引擎。为基础生物学过程和疾病状态的代谢异质性和代谢途径提供新见解。

技术实现思路

1、基于上述目的，本技术提供了：

2、在第一方面，本发明提供了用于辨认快型骨骼肌，或骨骼肌亚型2bmitolow，的生物标志物。

3、在一些实施方案中，所述生物标志物为选自下组的一项或多项：肌肽；鹅肌肽；肌苷酸(imp)；黄嘌呤酸(xmp)；dgdp；amp；atp；phosphoadenosine phosphosulfate；phosphoribosyl-formimino-aicar-phosphate(prfar)；糖酵解代谢产物；磷酸二羟基丙酮的酰化衍生物；二磷酸景天酮糖；嘌呤相关代谢产物；磷酸核糖；adp磷酸核糖；myh4；casq1；myl1；tnnc2；tnni2；tnnt3。在一些实施方案中，所述辨认以上生物标志物的方法是通过质谱成像代谢组学。

4、在一些实施方案中，所述生物标志物可用于动物肌肉，所述动物选自下组：猪、牛、马、狗、猫、山羊、绵羊、兔、猴、人、大鼠、小鼠、优选为小鼠。

5、在一些实施方案中，所述生物标志物是指相对于快型骨骼肌的含量上升超过30％、100％、300％、1000％、3000％或10000％。

6、在第二方面，本发明提供了用于辨认慢型骨骼肌，或骨骼肌亚型1和2a，的生物标志物。

7、在一些实施方案中，所述生物标志物为选自下组的一项或多项：线粒体三羧酸循环相关的代谢产物；丙酮酸；苹果酸；富马酸；天冬氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；adp；氧化磷酸化相关的辅因子；吡哆胺(维生素b6)；泛乙烯4’-磷酸(维生素b5)；nadh(维生素b3)；fad(维生素b2)；长链和支链脂肪酸的β氧化的代谢产物；乙酰肉碱；酰基肉碱；myh7；cyto c(细胞色素c)；casq2；myl3；tnnc1；tnni1；tnnt1。在一些实施方案中，所述辨认以上生物标志物的方法是通过质谱成像代谢组学。

8、在一些实施方案中，所述生物标志物可用于动物肌肉，所述动物选自下组：猪、牛、马、狗、猫、山羊、绵羊、兔、猴、人、大鼠、小鼠、优选为小鼠。

9、在一些实施方案中，所述生物标志物是指相对于快型骨骼肌的含量上升超过30％、100％、300％、1000％、3000％或10000％。

10、在第三方面，本发明提供了用于辨认超快型肢体骨骼肌，或骨骼肌亚型2bmitohigh，的生物标志物。

11、在一些实施方案中，所述生物标志物为选自下组的一项或多项：甲酰胺嘧啶核苷三磷酸；环状adp-核糖；adp-核糖环磷酸酯；焦磷酸硫胺素；羟基-damp；棕榈酰肉碱；磷酸肌苷；亚油酰肉碱；黄素单核甙酸；十四烷酰肉碱；十八烯酰基肉碱；羟基辛烯二酰肉碱；十六烯酰肉碱；mybph；myh13；myh8；mymx；myh1；actc1；map2；chrna2；atp6v1g2；ndufs2；ndufc1；ndufb4c；acaa2；acadl；acadm；acads；acadvl；acot1；acot2；acsl1；acss1；acssl2；eci1；hadha；hadhb；pank1；pck2；idh2；mdh1；sdhb；atp5g3；ndufa10；ndufv1；cyc1；cycs；uqcrfs1；apoc3；scl27a1；cd36；ppara；fabp3；plin5；ldhb；gck。在一些实施方案中，所述辨认以上生物标志物的方法是通过质谱成像代谢组学。

12、在一些实施方案中，所述生物标志物可用于动物肌肉，所述动物选自下组：猪、牛、马、狗、猫、山羊、绵羊、兔、猴、人、大鼠、小鼠、优选为小鼠。

13、在一些实施方案中，所述生物标志物是指相对于快型骨骼肌，或骨骼肌亚型2bmitolow的含量上升超过30％、100％、300％、1000％、3000％或10000％。

14、在一些实施方案中，所述生物标志物是通过结合纵向冷冻切片、质谱成像、液相质谱和rna测序，对单个肌纤维进行高空间代谢组学分析所获得。

15、在一些实施方案中，所述生物标志物可用于诊断肌肉发育不良或肌肉退化相关的疾病。

16、在一些实施方案中，所述生物标志物可作为动物体内外诱导慢、快或超快型肢体肌肉纤维的测定方法。

17、本技术的技术方案实现的有益技术效果

18、采用本技术的生物标志物，能超出预料地辨认慢、快或超快型肢体肌肉纤维，能作为动物体内外诱导慢、快或超快型肢体肌肉纤维的测定方法，以此诊断和治疗肌肉发育不良或退化相关的疾病。