用于鉴定可移植的组织样品的IgG亚型测定的制作方法

用于鉴定可移植的组织样品的igg亚型测定
1.本技术是申请日为2016年12月5日、申请号为201680080808.2、发明名称为“用于鉴定可移植的组织样品的igg亚型测定”的发明专利申请的分案申请。
2.发明背景
3.本发明一般涉及器官和组织移植领域，更具体地涉及用于匹配供体组织和受者的程序，如果组织被移植到受者，所述受者的身体不会排斥组织。
4.器官和组织从供体体内移植到受者体内已成为一种相对常见的手术。由于脊椎动物免疫系统的基本功能(即，提醒身体“非自身”材料并帮助消除这种非自身材料)，组织不能简单地从给定物种的一个个体的身体移植进入同一物种的任何其他个体的体内而没有免疫并发症的可能性。如果移植的组织与受者的免疫系统不相容，则受者的免疫系统可以对移植的组织产生反应，从而破坏移植的组织。为了避免这种移植排斥，可以采用两种基本策略。首先，可以抑制受者的一种或多种免疫功能，从而减轻或消除针对移植物的免疫应答。其次，可以筛选和匹配移植物和受者，以减少针对移植物的受者免疫应答的可能性和/或严重性。本文描述的主题主要针对该第二策略，尽管这两种策略不是相互排斥的-两者都可以用于相同的移植。
5.人们早就知道脊椎动物组织中的细胞在其表面上表达抗原，并且这些抗原可以在相同物种的个体之间显著变化。例如，人细胞在其表面上展示称为人白细胞抗原(hla)的蛋白质。对于任何个体，由个体的细胞显示的hla被个体的免疫系统识别为“自身”，并且个体的免疫系统不(通常)对其自身细胞产生免疫应答。然而，由不同个体人显示的hla可以变化很大，以至于通常不由个体细胞表达的hla，例如移植组织的hla，可以被个体的免疫系统识别为“非自身”，从而导致针对移植组织的免疫反应。如果针对移植组织发起的免疫应答足够严重以诱导大多数或所有移植细胞的死亡或足够的移植细胞外物质的破坏，则移植的组织可能不能表现出作为移植原因的所需功能或性质。也就是说，如果针对移植组织的受者免疫应答足够严重，则导致移植的目标可能无法实现。
6.受者的身体可以产生的抵抗移植组织的一种类型的免疫应答取决于受者身体产生的抗体与移植组织表面上展示的抗原(例如，hla)的结合。抗体与其相应抗原之间的特异性结合可以催化反应(“补体结合”)，其导致诱导针对移植组织的有效细胞毒性免疫应答。分析受者免疫系统组分检测供体组织为“非自身”并产生细胞毒性反应的能力并选择供体-受者对以避免此类反应通常称为“交叉配型”，并在文献中进行了广泛讨论(见例如，mulley等，2011，nephrology 16：125-133)。
7.一种已知的交叉配型技术涉及使从潜在移植组织的供体获得的淋巴细胞与从移植组织的建议受者获得的血清接触。血清包括在受者血液中循环的抗体。如果受者的血清包括与供体淋巴细胞上出现的抗原特异性结合的抗体，则可以检测到这种结合。在称为“流式交叉配型”的一种常见检测技术中，将供体淋巴细胞与受者血清接触一段时间，之后通过分离淋巴细胞和血清并用过量试剂冲洗淋巴细胞除去未结合的抗体。然后使淋巴细胞与能够检测受者抗体的标记试剂接触(例如，与人抗体结合的荧光抗体，任选特定类型的抗体，例如igm或igg，或亚型，例如igg1、igg2、igg3或igg4)，然后从淋巴细胞中冲洗未结合的标
记试剂。通过将淋巴细胞悬浮在流体中并使其通过能够检测标记试剂标记的流式细胞仪来检测受者抗体与供体淋巴细胞的结合。通过流式细胞仪检测标记物和淋巴细胞(例如，检测对应于荧光素的荧光)表明被标记试剂识别的一种或多种受者抗体与淋巴细胞结合。这种结合的受者抗体通常称为“抗供体抗体”(adab)。如果进行多个流式交叉配型反应，每个使用对不同受者抗体类型和/或亚型具有特异性的标记试剂，则可以开发存在于潜在受者血清中的adab的类型和亚型的概况。
8.已经观察到adab类型和亚型可以影响移植组织被受者排斥的可能性。例如，mulley等人认识到igg4不会激活补体，并且使用供体白细胞检测到的adab仅为igg4亚型的潜在受者可能不太可能在体内激活补体(即，表明可能是合适的供体-受者配对)。cicciarelli等报道了可比较的观察结果(美国专利申请公开号2010/0261203)。gao等人(2014，am.j.transplant.14(7)：1581-1591)认识到与凋亡细胞反应的亚型igg1和igg3的igg抗体更可能导致移植肾的晚期排斥，这些作者认为是可归因于igg1和igg3亚型的补体结合能力。然而，先前的工作人员检查了抗原包被的珠子和受者血清中的抗体之间的结合，该测定可能是费力的并且不一定表明受者抗体和供体细胞之间的相互作用。
9.需要能够快速且准确地确定潜在组织移植物对植入个体受者(或其上)的适合性的改进的交叉配型测定法。本公开内容描述了这样的测定。
10.

技术实现要素：
概述
11.本发明涉及评估潜在供体的身体组织与受者的移植相容性的方法。该方法包括使从潜在供体获得的白细胞与从受者获得的抗体接触。就至少igg亚型igg1和igg3评估潜在供体白细胞与受者抗体之间的结合。如果检测到供体白细胞与igg亚型igg1和igg3中任一种的受者抗体之间基本上没有结合，则评估身体组织与受者相容。本发明还涉及包括这种评估方法的组织移植程序。
12.在评估方法中，优选针对至少igg亚型igg1、igg2、igg3和igg4中的每一种评估供体白细胞与受者抗体之间的结合，优选使用可区别地识别亚型的差异标记的抗体，并且优选地在单个测定混合物中进行。如果需要，评估方法还可以包括使供体白细胞与差异标记的抗体接触，所述抗体可区别地识别供体的b和t细胞。在将供体白细胞与受者抗体接触后，可以通过流式细胞术评估个体供体白细胞与抗体和/或与其结合的标记。
13.评估方法适用于脊椎动物的受者，优选为人。
14.可以使用已知试剂抑制受者抗体和供体白细胞上的fc受体之间的非特异性结合。供体白细胞在与从受者获得的抗体接触时优选是活的。
15.附图简述
16.图1是说明本文实施例5中描述的实验结果的结果的表。
17.图2是说明本文实施例6中描述的实验结果的结果的表。
18.详细说明
19.本公开内容涉及用于使来自供体的组织与该组织的合适受者交叉配型的方法。该方法涉及确定含有从受者获得的抗体的样品(例如从受者血液制备的血清)中存在的抗供体igg亚型。
20.供体组织可以是已经从活体或最近死亡的脊椎动物(例如人类供体)收集(并且可能存储和/或冷冻)的组织，或者它可以是仍然是供体候选者的一部分的组织。在任何这些
情况下，从其收集或将来可能收集组织或从其尸体收集或将来可能收集组织的个体在本文中称为“供体”。交叉配型方法通常在供体组织从供体收集之后进行；然而，该方法可以在收集待移植的组织之前进行(例如，如果受者不是合适的受者则不收集该组织)，通过针对从候选受者获得的血清中的igg抗体亚型测试从供体获得的白细胞(即，如果在候选受者的血清中检测到抗供体igg1或igg3抗体亚型，则前述组织收获)。潜在的供体白细胞可以冷冻和存档，任选地与储存的供体组织一起或在储存的供体组织中。
21.该方法包括使从供体获得的白细胞(例如，外周血单核细胞)与从供体组织的潜在受者获得的样品(例如血清)中的抗体接触，并在检测后在单个测定中检测受者样品中存在的多种igg亚型的抗体(ab)是否与供体的白细胞结合。该评估优选通过流式细胞术使用含有多个差异标记的抗体的试剂进行，所述抗体各自仅与igg抗体的某些亚型(优选仅一种亚型)特异性结合。这种差异标记的ab在本文中描述为“可区别地识别”igg抗体的各种亚型。在将过量试剂与白细胞分离后，通过例如流式细胞术评估白细胞，以检测与白细胞相关的任何标记。根据该信息，可以确定哪种供体-白细胞结合igg亚型存在于受者血清中。如果需要，各种供体白细胞可以彼此区分，例如通过已知的流式细胞术方法，通过用一种或多种可区别地识别(即，可用于区分)t和b细胞的ab标记它们。在本文所述的测定中，受者igg1和/或igg3抗体与供体t细胞的结合通常表明相比于与供体b细胞的相同结合的更不利的匹配，尽管两种类型的结合表明比两种类型的结合不存在时更不利的匹配。
22.可以从受者的血液中获得受者抗体，例如通过从其分离血清(即，血液的无细胞液体组分)。受者抗体还可以或替代地用于或分离自已知或被认为含有代表患者身体的抗体的任何其他体液或洗涤/灌洗液。举例来说，受者抗体可以从胸膜抽吸物、支气管灌洗液或腹膜液样品中获得。无论如何获得或制备含有受者抗体的样品，重要的是以保持其中的igg1和/或igg3抗体与供体的白细胞结合的能力的方式处理和/或储存样品中存在的igg抗体(至少igg1和/或igg3亚型)。受者抗体的优选样品是血清。
23.如果受者样品含有igg1或igg3亚型的供体-白细胞结合igg抗体，则潜在受者可能不是供体组织的合适受者，并且供体组织不应与供体一起移植。受者样品中抗供体igg1或igg3亚型的出现表明如果将来自供体的组织移植到受者上，则可能发生移植物排斥症状。也就是说，这种情况表明，与受者的样品不含抗供体igg1或igg3亚型相比，更可能发生抗体介导的排斥。移植物排斥症状的可能性也可以至少与igg1和/或igg3的检测程度增加大致相关。因此，例如，白细胞在本文所述的测定中引起受者igg1和/或igg3抗体相对低水平结合的个体将被认为是优选的组织供体，与白细胞在该测定中引起受者igg1和/或igg3抗体的显著更高水平的结合的另一个个体相比。此外，鉴于已知igg3诱导补体结合的更大倾向，检测受者-igg3与供体白细胞的给定水平的结合(例如，高于正常背景水平的两倍)被认为是与受者-igg1与供体白细胞的相同水平的结合的检测相比不太有利的供体匹配的指示。通常，受者-igg3或-igg1与供体白细胞的结合的检测比这种结合的基础(即正常背景)水平高约2倍，则认为表明不利的供体匹配(即移植物排斥症状的可能性增加)，更高的检测结合通常表明更不利的供体匹配。
24.如果受者的样品不含有igg1或igg3亚型的供体-白细胞结合igg抗体，则潜在的受者可能是供体组织的合适受者，并且可以将供体组织移植到受者上，并合理地期望它不会被排斥(至少通过涉及补体结合的生理过程)。
25.因此，本文所述的方法可用于确定是否可以预期个体受者排斥从不同的个体供体(不同的，优选相同的物种)获得的组织。如果受者的样品包括igg1或igg3亚型的供体-白细胞结合抗体，则可以预期受者排斥从供体获得的组织，并且如果供体样品不包括igg1或igg3亚型的供体-白细胞结合抗体，则可以预期不会排斥组织(即使供体样品包括亚型igg2和/或igg4的供体-白细胞结合抗体)。
26.与现有方法相反，所描述的方法不仅识别可能成功的组织移植物(其可以使用先前的方法鉴定，所述方法依赖于检测未分化亚型的igg的供体-白细胞结合抗体)，而且还识别可能成功的使用现有方法无法识别的组织移植物。
27.本方法具有以下优点：可以使用样品的单个等分试样在单一反应混合物中进行多次评估(例如，igg1的检测和igg3的检测)。因为所有多次评估都是使用相同的样品进行的，所以避免了因多次测定依赖多种相应对照而产生的困难。
28.本方法具有另外的优点，即它们使用完整的供体细胞而不是与供体抗原连接的合成珠进行。可以预期供体细胞(例如，活pbmc)密切模拟供体组织的抗原呈递；相反，带有供体抗原的合成珠可以以与供体组织呈递相同抗原的方式显著不同地呈递供体抗原。因此，可以预期本文描述的方法更准确地预测受者对供体组织的反应。
29.本文描述的方法用于使人类受者与组织的人类供体进行匹配。然而，还应理解，仅使用常规修改的相同方法可用于使基本上任何脊椎动物物种的个体受者与相同物种的组织的供体相匹配。同样地，通过常规修改的相同方法可以用于使第一脊椎动物物种的个体受者与从第二种不同脊椎动物物种的供体获得的组织进行匹配(尽管认识到可能进行受者适当性的其他测定用于物种间组织移植)。
实施例
30.现在参考以下实施例描述本公开内容的主题。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且主题不限于这些实施例，而是包括由于本文提供的教导内容而明显的所有变化。
31.实施例1
32.从供体血液中分离pbmc
33.从供体全血中分离外周血单核细胞(pbmc，其包括淋巴细胞和单核细胞)，所述供体全血在柠檬酸葡萄糖(acd)真空管中收集。将供体血液转移至15毫升锥形管中并通过倒置与2毫升甲基纤维素(1％溶液，重量/体积；sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)混合。将管在37摄氏度的培养箱中旋转15分钟，并在37摄氏度下静置另外30分钟，以将含有富集的淋巴细胞的血浆层与红细胞层分离。将血浆层小心地转移到新的15毫升锥形管中，并用dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs，lonza，walkersville，md，usa)以1：1的比例(血浆：dpbs)稀释，并通过倒置混合。
34.使用巴斯德吸管，用淋巴细胞分离介质(lsm)覆盖稀释的血浆，使得稀释的血浆：lsm的比例为1：1。将管在22摄氏度下在摆动桶转子中以400
×
g离心25分钟，使用缓慢减速。将含有pbmc的界面处的透明白色条带转移到新的15毫升锥形管中，并用dpbs稀释至终体积10毫升。将管在22℃下以260
×
g离心10分钟以沉淀pbmc。弃去含有血小板的上清液，留下富含pbmc的沉淀。将沉淀小心地重悬于2毫升dpbs中，并使用1：2稀释的台盼蓝在血细胞计数器中对细胞计数。
35.igg亚型测定
36.使用高灵敏度流式细胞术交叉配型(fcxm)平台进行igg亚型分析，如下所述。简言之，将从供体血液中分离的pbmc等分到单独的5毫升聚苯乙烯圆底管中，浓度为5x 105个细胞/管。用dpbs洗涤细胞，并通过在22℃下以800
×
g离心5分钟沉淀。使用fc受体阻断剂试剂(从innovex biosciences，richmond，ca，usa获得)在室温(约20摄氏度)下封闭细胞表面上的fc受体10分钟。通过用dpbs洗涤细胞两次，然后在4摄氏度下与患者(即受者)血清一起孵育30分钟，除去封闭试剂。还将供体细胞与阴性和阳性对照血清样品一起孵育。通过汇集来自5名高度致敏的患者(每种患者的cpra值大于98％)的血清制备阳性对照血清。该阳性血清与来自所有供体的pbmc细胞反应，产生始终如一的阳性fcxm结果。在美国fda许可的设施中从ab血清型的健康男性供体收集阴性对照血清(从gemini bio-products，west sacramento，ca，usa获得)。该材料从源血浆ab中去纤维。测试所有供体单位的病毒标记物，发现它们是非反应性的。该血清产生始终如一的阴性fcxm结果。
37.孵育后，用含有dpbs和1％胎牛血清(fbs，gemini bio-products，west sacramento，ca，usa)的洗涤缓冲液洗涤细胞。将细胞重悬浮于洗涤缓冲液中并转移至含有差异标记抗体的冻干定制混合物的单独管中，所述抗体特异性识别各种igg亚类(获自bd lyotube，bd pharmingen，san jose，ca，usa)。用冻干的抗体混合物孵育供体细胞在黑暗中进行20分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤细胞以除去过量的抗体。
38.使用本文所述的多色流式细胞术检测方法检测与细胞结合的特异性抗hla igg亚型抗体。将患者血清中的igg亚型水平与阴性对照血清中观察到的水平进行比较。计算患者血清中igg亚型水平相对于阴性对照血清的倍数变化。患者血清中igg亚型的水平比阴性对照血清中的水平高2倍，则表明对于该亚型是阳性的。
39.实施例2
40.通过流式细胞术鉴定igg亚型的方案
41.以下描述类似于实施例1中描述的程序，具有一些微小的变化。
42.从全血中分离pbmc或使用冷冻的pbmc。
43.用磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)洗涤两次并进行活力计数。
44.以1500rpm离心5分钟。
45.弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每107个细胞0.3ml fcr阻断剂中(innovex cat#nb309)。
46.在室温(约20摄氏度)下孵育10分钟。
47.用过量的pbs洗涤两次。
48.将细胞以107个细胞/ml重悬于染色缓冲液(即磷酸盐缓冲盐水，ph7.4，含有5％v/v胎牛血清)中。
49.将每个测试100微升(每个测试106个)细胞悬浮液等分至每个12x75mm管。
50.向每个管中加入20微升纯的血清。
51.在4摄氏度下孵育30分钟。
52.用2.5ml染色缓冲液洗涤。
53.弃去上清液。
54.重悬于100微升染色缓冲液中并将内容物转移至lyotube。
55.在室温下孵育20分钟。
56.用2.5ml染色缓冲液洗涤。
57.弃去上清液并重悬于0.4ml的染色缓冲液中。
58.获取样品，测量单个igg亚型的量。
59.实施例3
60.在阳性流动-细胞计数交叉匹配(fcxm)的心脏移植中使用igg分型
61.由于超急性排斥和抗体介导的排斥(amr)的风险，阳性fcxm通常是心脏移植的障碍。虽然对供体特异性抗体的存在高度敏感，但fxcm不确定这些抗体是否与补体结合。
62.病例报告：在心肌梗塞和冠状动脉旁路移植术后发生冠状动脉疾病的61岁非洲裔美国男性，其由于缺血性心肌病而发生心力衰竭，射血分数(ef)为15-20％。尽管进行了药物治疗和植入心脏再同步治疗装置，由于进行性症状，他将心脏伴侣ii左心室辅助装置(lvad)植入作为移植的桥梁。lvad后病程因需要多次输血的复发性胃肠道出血以及传动系出口部位感染而复杂化。他升级到1a状态，但由于高群体反应性抗体(pra)(i类69％，ii类3％)而无法获得供体。使用血浆去除术、静脉内免疫球蛋白、利妥昔单抗、霉酚酸酯和硼替佐米尝试脱敏，但没有显著反应。
63.鉴定了合适的供体，其具有对预期交叉配型的阴性补体依赖性细胞毒性结果。然而，fcxm对t细胞和b细胞均呈强阳性(中位通道移位：t细胞362/50，b细胞359/100)。使用识别不同igg亚型的定制抗体进行受者血清分析。在4种igg亚型中，在受者血清中仅鉴定出亚型2和4。由于仅已知igg亚型1和3是补体结合的，因此认为进行移植是安全的。
64.进行心脏移植并且受者接受使用巴利昔单抗的诱导免疫抑制疗法(“诱导性”)以及使用泼尼松、他克莫司和霉酚酸酯的方案免疫抑制。他在术后立即有正常的移植功能，没有超急性排斥反应。移植后12天进行的重复回声显示正常的双心室功能。他在12个月内进行了14项方案心内膜心肌活检，未见明显的细胞排斥反应。所有c4d和cd68样品的染色均未显示抗体介导的排斥反应的证据。他在第一次年度访问时继续保持良好的移植功能ef 70％。此时进行的瑞加诺生压力测试显示没有缺血迹象。
65.在该实施例中描述的是尽管存在阳性fcxm，但利用igg分型进行心脏移植的情况。在受者血清上缺乏补体结合igg亚型1和3导致心脏移植成功，在1年后没有发生排斥反应，并且具有正常移植物功能。
66.实施例4
67.制备适用于四种igg亚型的同时流式细胞术鉴定的试剂的方法
68.1.从不同公司购买荧光标记的各个抗-igg1、2、3、4抗体(ab)并确定这些抗体的克隆。
69.2.评估每个克隆以适合于实验(第二抗igg抗体与pbmc上与hla抗原(ag)连接的第一抗体的结合)。
70.3.确定需要包含在试剂中的每种第二抗-igg ab的量。这需要每个抗igg ab单独进行实验。
71.4.用4种抗igg抗体的组合(以2种、3种或全部4种在一起的组)进行实验，并确定是否存在阻止第二抗体与结合至pbmc上的hla ag的第一抗体结合的任何空间位阻。如果是这样，选择一个或多个不同的ab代替至少一个被空间位阻的ab。
72.5.选择用于阻断fc受体的试剂作为备用。目前使用的试剂是“fc受体阻断剂”，其可商购获得，如上所述，并且按照预期工作。其他是本领域中已知的。
73.6.获得用各个igg亚型标记的“标准珠”，用作每个实验进行的内部实验标准。
74.7.用标准珠和新分离的pbmc进行上述试剂的标准化。试剂的标准化需要使用相同浓度的抗-igg抗体进行多次实验，如上所述，使用相同量的标准珠，但使用从各种供体分离的pbmc。这表明，对于所进行的每个实验，结果与标准珠一致，并且该测定可以检测与从各种供体分离的pbmc结合的igg亚型水平。
75.8.使用来自多个供体(例如，20个或更多个供体)的新鲜分离的pbmc验证上述标准化实验。
76.这些步骤中的每一个优选地是文档，以便如果必要或期望的话，细节可供管理机构检查。
77.实施例5
78.igg亚型特异性流式交叉配型测定可以增加致敏肾受者中成功移植的次数
79.阳性流式细胞计数交叉配型(fxcm)被认为是成功肾移植的禁忌征象。标准fxcm不区分免疫球蛋白分子的各种亚型(igg1、igg2、igg3和igg4)。只有igg1和igg3亚型能够最大补体激活。igg2和igg4是相对良性的。我们提出了我们的研究的初步结果，该研究评估了一种新的fcxm测试，该测试专门检测和定量负责阳性交叉配型的igg亚型。
80.现在描述在该实施例中描述的实验中使用的方法。评估来自7个受者的移植前血清和来自其各自供体的血液样品。使用fcxm进行igg亚型分析。将从供体样品中分离的pbmc与患者和对照血清一起孵育。然后将细胞在冻干的定制抗体混合物中孵育，所述抗体特异性识别与细胞结合的各种igg亚型，然后进行fcxm分析。对所有血清进行c1q(补体激活)测试。
81.这些实验的结果如下。标准fcxm在所研究的大多数病例中均为阳性(5/7)，因此通常不会仅根据这些结果进行移植。然而，使用本文所述的igg亚型分析，我们能够确定阳性交叉配型结果可归因于非补体结合性igg2或igg4抗体的存在，并且可以进行移植。igg分型和c1q结果几乎完全一致。所有病例均显示非补体激活抗体的存在负责阳性fcxm(cf除外)。cfl显示具有阴性c1q的igg3抗体的存在；可能是变性抗体的结果。在任何一个病例中都没有观察到临床排斥发作或者对于任何受者在第一周内均没有透析要求。这些结果总结在图1所示的表中。在图1中，“cr.”是指血清肌酸测定。
82.本实施例中描述的实验证明我们已经开发了igg亚型fcxm测定，其具有鉴定补体激活抗体的存在的能力。该测定已显示其在检测引起阳性流式交叉配型的igg亚型方面是高度准确的。即使在高致敏受者的阳性fcxm存在下，该测定的使用也可能导致成功的移植。
83.实施例6
84.使用新的流式交叉配型测定区分igg亚型来增加致敏心脏和肾受者中的成功移植
85.移植程序不希望在存在阳性流式交叉配型的情况下进行移植。标准流式细胞计数交叉配型(fcxm)不区分免疫球蛋白分子的各种亚型(igg1、igg2、igg3和igg4)。我们开发了一种新的fcxm分析，能够特异性检测和定量补体激活(igg1和igg3)和非补体激活(igg2和igg4)igg抗体的量。我们使用该测定法在两个单独的心脏和肾脏移植模型中提供初步结果。我们证明，使用能够区分各种igg亚型的该测定可以在阳性交叉配型存在下实现成功移
植。
86.现在描述在该实施例中描述的实验中使用的方法。来自7个心脏受者(包括实施例3中描述的那些)和7个肾脏受者的移植前血清和来自其各自供体的血液样品用于该研究。使用fcxm进行igg亚型分析。将从供体样品中分离的pbmc与患者和对照血清一起孵育。然后将细胞在冻干的定制抗体混合物中孵育，所述抗体特异性识别与细胞结合的各种igg亚型，然后进行fcxm分析。对所有血清进行c1q测试。
87.在实施例5和图1中描述了肾受者患者获得的结果。
88.对心脏受者患者获得的结果如下。研究的大多数心脏移植病例(6/7)具有阳性交叉配型，因此通常不会进行移植。然而，使用本文所述的igg亚型分析，我们能够确定阳性交叉配型结果可归因于非补体结合性igg2或igg4抗体的存在，并且可以进行移植。在大多数情况下，c1q结果与交叉匹配结果一致。两例(jo，mp)为c1q阳性；可能是由于hla特异性igm抗体的前带效应。所有病例在移植后均具有阳性的30天和90天存活率，没有原发移植物功能障碍或》2r排斥(使用国际心肺移植协会护理心脏移植受者的术语)。记录了抗体介导的排斥反应并且接受了诱导治疗的两个病例(jf，rp)继续具有正常的移植功能。这些结果总结在图2所示的表中。
89.本实施例和实施例5中描述的实验证明，本文所述的igg亚型测定对于检测引起阳性流式交叉配型的igg亚型是高度准确的。这些结果首次证明，即使在存在通常禁忌的标准阳性流式交叉配型的情况下，该测定也可促进安全移植。我们的igg亚型测定的临床实施可以对增加成功移植的数量产生很大影响，特别是在致敏受者中。
90.本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。
91.虽然已经参考具体实施方案公开了该主题，但是明显的是，在不脱离本文描述的主题的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设计出其他实施方案和变型。所附权利要求包括所有这些实施例和等同变型。